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    左旋四氫巴馬汀對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷后海馬CA1區Fas和F
    關鍵字:損傷,對大,GH,KL,EF,CD,yz,AB,MN,OP, 發布時間:2011-08-21

    醫藥導報2010年9月第29卷第9期 ?藥物研究? 左旋四氫巴馬汀對大鼠局灶性腦缺血一再灌注損傷后 海馬CA,區Fas和FasL蛋白表達的影響 馬小亞1,武冬梅2,李 明3 (1.兩安交通大學醫學院第二附屬醫院藥劑科,710004;2.西安市兒奄醫院,710003;3.西安交通大學醫學院組織 胚胎學教研室,710061) [摘要]目的探討左旋四氫巴馬汀(L-THP)對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的保護作用及對海馬CA.區凋 亡蛋白Fas、FasL表達的影響。方法參照改良Longa法建立局灶性腦缺血-再灌注模型,應用ImageProPlus6.0專業圖 像分析軟件測定腦梗死體積,比色法測定肌酸激酶(CK)活力,用免疫組化法分別檢測缺血側海馬CA.區Fas、FasL陽性 表達。結果與模型組比較,L?THP能夠縮小局灶性腦缺血一再灌注損傷大鼠腦梗死體積,降低血清CK活力。降低缺血 側海馬CA。區Fas、FasL凋亡蛋白的表迭。結論L.THP可能通過抑制神經元凋亡蛋白Fas、FasL表達,而對腦組織起到 保護作用。 [關鍵詞]四氫巴馬汀,左旋;腦缺血-再灌注損傷;腦保護作用;神經元凋亡蛋白 [中圖分類號]R971.1;R743[文獻標識碼]A[文章編號]1004—0781(2010)09一lll5—05 TheEffectsofL-tetrahydropalmatineontheExpressionofApoptosisProteinFasand FasLinHimppocampalCA lafterFocalCerebralIschemiaReperfusionInjuryin Rats MAXiao-yal,wUDong—mei2,LIMin93(1.DepartmentofPharmacy,theSecondAffiliatedHospital,Schoolof Medicine,Xi7anJiaotongUniversity,Xian710004,China;2.XianChildrensHospital,Xi7an710003,China; 3.DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofMedicine,Xi。anJiaotongUniversity,Xt’an710061, China) ABSTRACT Objective TostudytheprotectiveeffectsofL—tetrahydropalmatine(L?THP)onfocalcerebralischemia reperfusioninjuryinratsandexpressionofapoptosisproteinFasandFasLinhimppocampalCAl. MethodsModifiedlJ0nga methodwasemployedtoestablishtheanimalmodeloffocalcerebralischemiareperfusion,ImageProPlus6.0softwarewasused todetectvolumeofcerebralinfarction,creatinekinase(CK)levelwasexaminedbyeolorimetry,andimmunohistochemical methodwasappliedtoanalyzeFasandFasLexpressedcells.Results Comparedwithmodelcontrol,L—THPdecreasedinfarct volume,CKactivityandreducedthelevelofFasandFasLinhimppocampalCAlafterfocalcerebralischemiarepeffusioninjury inrats.ConclusionLTHPhasthepmtectiveeffectonfocalcerebralischemiareperfusioninjurybyinhibitingneuron expressionofapoptosisproteinFasandFasL. KEYWORDS L-tetrahydropalmatine;Cerebralischemiareperfusioninjury;Cerebralprotectioneffect;Apoptosisprotein ofuelve‘:eU 腦血管疾病是嚴重威脅人類生命健康的常見疾病 之一,其中缺血性腦血管病發病人數較多,約占腦血管 疾病患者的70%。腦缺血損傷可以導致遲發性神經 元死亡(DND)。研究表明,神經元凋亡在DND的發 展過程中起重要作用,Fas、FasL是凋亡誘導家族的重 [收稿日期]2009—08—21[修回日期]2009—09—28 [基金項目]‘陜西省科學技術研究發展計劃項目[基金編 號:2008K13-02(2)] [作者簡介]馬小-啞(1965一),女,陜西綏德人,副主任藥 師,碩士生導師,碩士,研究方向:臨床藥理學。電話:029— 87679250,E,mail:mxy916@163.com。 要成員之一,兩者的結合是細胞凋亡的重要調節機 制。“。左旋四氫巴馬汀(L—tetrahydmpalmatine,L. THP)作為鎮痛、鎮靜、催眠藥物已應用臨床多年,基礎 研究發現,L—THP是植物性鈣離子阻滯藥,具有抗心肌 缺血、減輕大鼠全腦缺血一再灌注損傷及減少神經元凋 亡的作用。筆者在本實驗研究L—THP對局灶性腦缺 血一再灌注損傷的保護作用及對神經元凋亡蛋白Fas、 FasL表達的影響。 1材料與方法 1.1實驗動物健康SD品系大鼠160只,平均體質 量(240+20)g,雌雄兼有,由西安交通大學動物實驗 萬方數據 換頁 ?1116?HeraldofMedicineV01.29No.9September2010 中心提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(陜)2007. 001。 1.2藥物與試劑 受試藥物:左旋四氫巴馬汀(羅通 定片,湖南洞庭藥業股份有限公司提供,批號:070609, 每片含L.THP30mg),實驗前以純化水配成0.4%, 0.2%,0.1%的混懸液,臨用前用渦旋混合器混勻后使 用。陽性對照藥:尼莫地平片(正大青春寶藥業有限 公司生產,批號:070987,每片含尼莫地平20mg),以 純化水配成0.1%的混懸液。10%水合氯醛(西安交 通大學醫學院第二附屬醫院制劑室生產)。肌酸激酶 (CK)試劑盒(南京建成生物工程研究所提供);兔抗 鼠Fas、FasL多克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體及免疫組 化DAB顯色劑(北京奧博森生物技術有限公司提供。 1.3儀器SD-78型雙極電凝器(上海醫用電子儀器 廠)。UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)。 AO組織切片機(美國optical公司)。PYX—DHS隔水式 電熱恒溫培養箱(上海市躍進醫療器械廠)。FM包埋 箱(上海福瑪實驗設備有限公司)。OlympusBx40型光 學顯微鏡(日本Olympus株式會社)。Q550CW圖像信 號采集與分析系統(德國LEICA公司)。 1.4實驗動物分組與給藥方法①將60只大鼠隨機 分為6組,每組10只。假手術組、模型組給予純化水 10mL?kg~,陽性對照組給予尼莫地平溶液 10mg?kg一,低、中和高劑量藥物組給予L—THPl0,20, 40mg?kg~。在缺血2h再灌注6h測定腦梗死體積 和血清CK活力。②將100只大鼠隨機分為5組,假 手術組、模型組給予純化水10mL?kg~,陽性對照組 給予尼莫地平溶液10mg?kg~,中和高劑量藥物組給 予L—THP20,40mg?kg~,每組根據缺血一再灌注時間, 分別缺血2h再灌注6,12,24,48h,合計20小組。免 疫組化法測定Fas、FasL的陽性表達。各組動物連續 灌胃給藥5d,qd,再灌注期間連續給藥。 1.5模型的制備大鼠局灶性腦缺血一再灌注模型的 制備采用Longa法稍作改良心j,建立大鼠大腦中動脈 阻塞(MCAO)局灶性腦缺血一再灌注模型:麻醉大鼠, 于頸部左側做切口,在頸外動脈(ECA)剪--d,口,將 線栓自ECA經頸總動脈(CCA)分叉處插入頸內動脈 (ICA),將線栓推至大腦中動脈(MCA),待大鼠麻醉清 醒后,若觀察到行走時向右側轉圈即認為符合實驗的 入組標準,到各灌注時間拔出線栓,實行再灌注。假手 術組僅將尼龍線放入ECA,不進入ICA。 1.6血清CK活力測定采用摘眼球法,取大鼠新鮮 血液2mL,待血清析出后,3000r?min‘1(r--15em)離 心10rain。取上層血清約1mL,裝于具塞離心管中, 參照CK試劑盒說明書,按步驟操作,室溫下用紫外分 光光度計測定各組吸光度(A值),計算CK活力。 1.7腦梗死體積測定將進行完眼球取血的大鼠迅 速斷頭處死,取出全腦,一20℃速凍10min,去除嗅球、 小腦和低位腦千,然后將腦從額極至枕極連續冠狀切 片,每2mm一張,共5或6片。將腦切片放入1% ,rrc磷酸緩沖液中,在37℃水浴箱中溫孵30min,用 10%多聚甲醛固定24h后,將固定的腦片按切片順序 排列,數碼相機攝相。利用ImageProPlus6.0專業圖 像分析軟件測出每個腦片梗死面積,梗死體積=梗死 面積X厚度(2mm),并將所得數值相加得全腦梗死灶 體積的近似值。 1.8標本采集和組織切片的制備將缺血一再灌注不 同時間段的大鼠,用10%水合氯醛3mL?kg。1腹腔麻 醉,暴露心臟,用灌注器經心尖、左心室插入到主動脈 內,先用0.9%氯化鈉溶液,然后改用4%多聚甲醛灌 注、固定大鼠約1h,灌注完畢后,取出全腦去除嗅球、 小腦及低位腦干后,冠狀切取海馬區腦組織,浸于原固 定液24h(4℃)后,取出流動水沖洗24h,再將沖洗后 的腦組織經85%乙醇浸泡脫水以備石蠟切片。經常 規梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋,切片,用于 Fas、Fasl免疫組化染色。 1.9圖像分析及采集 免疫組化染色后在400倍光 學顯微鏡下,在大鼠缺血側海馬CA.區隨機選取5個 視野進行觀察,以細胞內出現鮮亮的棕黃色顆粒為陽 性細胞。并記錄Fas、FasL陽性細胞表達總數,取其平 均值。然后采用圖像信息采集與分析系統采集圖片。 1.10統計學方法實驗數據以均數±標準差(i±s) 表示,采用SPSSl3.0統計軟件進行分析,兩組以上計 量數據比較采用單因素方差分析(one—way,ANOVA), 其中兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05表示差異有顯 著性。 2結果 2.1大鼠腦梗死體積和血清CK活力的檢測結果 TTC染色后觀察到,正常組織呈紅色,梗死灶呈蒼白 色,界限明顯。假手術組腦組織均勻紅染無梗死灶,其 他各組非缺血側染色基本呈紅色,腦缺血一再灌注后腦 梗死體積明顯增大,缺血側模型組梗死范圍最大,其他 給藥組梗死范圍有不同程度的縮小。與模型組比較, 陽性對照組、高劑量藥物組的腦梗死體積明顯減少 (P<0.01),而低劑量和中劑量藥物組腦梗死體積雖有 所縮小,但差異無顯著性。可見L—THP可以縮小由于 局灶性腦缺血一再灌注損傷造成的腦梗死體積。模型 組與假手術組比較,大鼠腦缺血一再灌注后血清CK活 萬方數據 換頁 醫藥導報2010年9月第29卷第9期 ?1l17? 力明顯升高(P<O.01)。與模型組比較,陽性對照組、 中劑量和高劑量藥物組血清CK活力明顯降低(P< 0.01)。低劑量藥物組CK活力雖有所降低,但差異無 顯著性。說明L-THP具有降低局灶性腦缺血一再灌注 大鼠血清CK活力的作用。見表1。 表1L.THP對局灶性腦缺血.再灌注大鼠腦梗死體積、血 清CK活力的影響 Tab.1TheeffectsofL.THPonvolumeofcerebral infarctionandserumCKactivityafterfocalcerebralischemia- reperfusioninrats i+s 緝別 大鼠/ 劑量/腦梗死體積/ CK/ 4… 只 (mg?kg。) (mm3)(g?L。) 高劑饋藥物組 lO40173.0±53.8“1.6±0.4“ 中劑量藥物組 lO20255.1±57.22.3±0.7“ 低劑苗藥物組 1010282.2_+27.52.8±0.4 陽性對照組 lO10 180.1-+58.1“1.0+0.3“ 模型組 10 … 294.0±72.8“3.3+0.4也 假于術組 10…0.0土0.00.9±O.1 與模型組比較,“P<O.01;與假手術組比較,~P<O.Ol Comparedwiththemodelgroup,“P<0.0l;Comparedwith theshamoperationgroup,“P<0.01 2.2大鼠神經元Fas蛋白表達情況與假手術組比 較,模型組中海馬CA,區Fas的陽性細胞表達在各灌 注時間段均明顯增加(P<0.01)。在腦缺血2h再灌 注6h陽性表達就開始增多,隨著再灌注時間的延長, 在再灌注24h時Fas的陽性細胞表達數相對6,12h 有所增多,達到高峰,在48h降低。與模型組比較,陽 性對照組,中劑量和高劑量藥物組在海馬CA。區Fas 的陽性細胞表達在各灌注時間均有所減少,差異有顯 著性或極顯著性(P<O.05或P<O.01)。說明L—THP 能減少局灶性腦缺血一再灌注損傷大鼠海馬CA。區Fas 的陽性細胞表達。與陽性對照組比較,中劑量和高劑 量藥物組在降低大鼠局灶性腦缺血一再灌注后海馬 CA.區Fas陽性細胞表達方面差異無顯著性。見表2。 光學顯微鏡下觀察到缺血側假手術組海馬CA,區可見 散在少量Fas陽性細胞表達,模型組可見主要表達在 胞質和胞核的淡棕色的弱陽性顆粒沉積。其余各干預 組見少量淡棕色的陽性細胞。見圖1。 2.3大鼠神經元FasL蛋白表達情況腦缺血一再灌 注后,模型組在缺血2h再灌注6h開始FasL陽性細 胞有明顯表達,在再灌注24h時表達的陽性細胞數明 顯增多,達到高峰,在48h開始趨于降低。與假手術 組比較,海馬CA。區FasL的陽性細胞表達在再灌注6, 12,24h均明顯增加,差異有顯著性或極顯著性(JP< 0.05或P<0.01),再灌注48h組雖然FasL蛋白陽性 表達數增多,但差異無顯著性。說明局灶性腦缺血一再 表2L-THP對局灶性腦缺血-再灌注大鼠海馬CA。區Fas陽性細胞表達的影響 Tab.2TheeffectsofL-THPontheexpressionofFas-positivecellsafterfocalcerebralischemia-reperfusioninhippocampal CA,amofratsi±s 。。 大鼠/ 劑量/ 海馬CA,【)(Fas孵j性細胞數 …。 只(mg.kz一1) 6h12h24h48h 高劑最藥物組 2040 4.7±0.6“6.7-.1.5”6.0±0.3“5.1±0.2“ 中劑量藥物組 2020 6.0±0.5“7.0±0.4”8.0±0.4“9.0+1.6n 陽性對照組 20lO5.O-vO.6“6.0±0.2“ 6.0±0.9“4.8-+0.2“ 模型組 20 … 11.0±0.7”14.0+0.6”16.O±1.4“11.0±1.6婦 假手術組 20 … 3.0±0.24.0+0.37.O±0.34.0±0.4 與模型組比較,“P<0.01,“P<0.05;與假手術組比較,”P<0.01 Comparedwiththemodelgroup,“P<O.01,”P<O.05;Comparedwiththeshamoperationgroup,”P<0.Ol AB C DE 圖1各組再灌注24h海馬CA,區FAS免疫組化染色(×400) A:假手術組;B.模型組;C.陽性對照組;D.高劑量藥物組;E.中劑量藥物組 Fig.1 ImmunohistochemicalstaininginofFAShippocampalCAlan組at24hafterreperfusion(x400) A.shamoperationgroup;B.modelgroup;C.positivecontroldruggroup;D.highdosedruggroup;E.mediumdosedruggroup 萬方數據 換頁 ?1118?HeraldofMedicineV01.29No.9September2010 灌注損傷能夠引起腦組織FasL的陽性表達。與模型重要的臨床意義。因線栓法MCAO模型具有不開顱、 組比較,陽性對照組在各灌注時間均能降低海馬CA,損傷小、效果穩定且可準確控制缺血及再灌注時間的 區FasL的陽性細胞表達,在再灌注24h作用顯著(P< 優點而被認為是腦缺血-再灌注損傷的標準模型"J。 0.01),各給藥干預組中,高劑龜藥物組在海馬CA,區實驗采用嚴格的動物實驗納入標準和1Trc染色結合 FasL的陽性表達在灌注6,12,24h時均有明顯的減的方法,雙鶯標準驗證r腦缺血動物模型是否合格。 少,差異有顯著性或極顯著性(P<O.05或P<0.01),在腦缺血引起腦血流阻斷后,短期的腦組織缺血后 再灌注48h時雖有所減少,但差異無顯著性。說明應再灌注可以減輕缺血引起的腦損傷,但長時間的缺血 用L—THP40mg?kg‘1能夠降低局灶性腦缺血-再灌注恢復血液灌流后不但不能恢復其功能和結構,反而加 損傷后腦內FasL的陽性表達,在缺血-再灌注早期作重其功能障礙和結構損傷。目前多認為MCAO缺血 用顯著。與陽性對照組比較,中劑量和高劑量藥物組 90—180min為理想的缺血時間【4]。本實驗在預實驗 差異無顯著性。說明陽性對照組與中劑量和高劑量藥期間通過1Trc染色分別比較在缺血1,2,3h時,腦組 物組降低局灶性缺血一再灌注大鼠腦內FasL陽性表達織梗死面積的大小,發現缺血1h腦梗死面積較小,缺 方面差異無顯著性。見表3。光學顯微鏡下觀察到缺 血2h時梗死面積增大,且比較穩定,3h時可以獲得 血側假手術組海馬CA,區可見散在分布表達FasL蛋最大的梗死面積。通過比較缺血.再灌注后動物的死 白的陽性細胞,模型組海馬CA,區明顯觀察到棕黃色亡率,發現缺血2h再灌注48h動物的死亡率為13%, 分布的陽性細胞,表現為細胞固縮、深染、結構不清,細 缺血3h再灌注48h后動物的死亡率達到39%,因此 胞膜或胞質有棕黃色顆粒沉積,以細胞膜陽性顆粒沉本實驗選擇缺血2h既滿足了缺血一再灌注后治療所要 積最為明顯。其余各給藥干預組FasL陽性細胞數明求的最佳治療時間窗,又能提高實驗的成功率,可以有 顯減少。見圖2。效反映L—THP抗局灶性腦缺血一再灌注損傷的治療效 3討論果及能更好的研究L—THP保護腦缺血?再灌注損傷的 臨床缺血性腦血管病中,60%患者為大腦中動脈機制。 閉塞,因此研究MCAO所造成的腦缺ffIL疾病具有十分7rrc染色腑梗死體積測量是研究藥物對腦血管疾 表3L-THP對局灶性腦缺血一再灌注大鼠海馬CA。區FasL陽性細胞表達的影響 Tab.3TheeffectsofL-THPontheexpressionofFasL-positivecellsafterfocalcerebralischemia-reperfusioninhippocampal CA.areaofratsi±s 高劑苗藥物組 20406.1±0.9”9.5±0.7“13.7±2.3“14.2±2.9 中劑量藥物組 20 2012.2±3.6 14.8+2.015.0+1.6“12.3±2.0 陽性對照組 201010.3±2.5 12.4±1.613.4+1.7“ 12.6±2.2 模型組 20 … 11.3士0.8“18.4+2.1”25.8-+3.4“ 15.2±2.1 假手術組 20 … 6.2±1.28.7-+1.66.2±1.39.3-+1.9 與模型組比較,“P<0.05。一P<0.Ol;與假手術比較,“P<0.05,“P<0.Ol Comparedwiththemodelgroup,‘1P<0.05,’2P<0.01;Comparedwiththeshamoperationgroup,+3P<O.05,’4P<O.01 AB C DE 圖2各組再灌注24h海馬CAl區FasL免疫組化染色()<400) A.假手術組;B.模型組;c.陽性對照組;D.高劑量藥物組;E.中劑量藥物組 Fig.2InnnunohistochemicalstainingofFasLinhippocampalCAl areaat24hafterreperfusion(×400) A.shamoperationgroup;B.modelgroup;C.positivecontrolgroup;D.highdosedruggroup;E.mediumdosedruggroup 萬方數據 換頁 醫藥導報2010年9月第29卷第9期 -1l19? 病療效的常規方法,是神經保護藥物基礎研究的重要 評價指標,具有簡捷、直觀的特點。其基本原理:TTc (2,3,5一氯化三苯基四氮唑)是一種脂溶性光敏感復合 物,它是呼吸鏈中吡啶.核苷結構酶系統的質子受體, 與正常腦組織中的脫氫酶反應而罨深紅色脂溶性物 質,而梗死組織內因脫氫酶活性下降,不能反應,故不 顯色而呈蒼白色。實驗中通過1TrC染色測定腦組織 梗死體積發現,假手術組未見腦梗死灶,腦片成均勻紅 染。模型組腑梗死體積最大,在冠狀切片中,以第3片 腦片梗死范圍最大,這與大腦中動脈所支配的供血區 域相吻合。實驗結果表明L—THP可以挽救因缺血引 起的缺血半暗帶內的細胞,縮小由于局灶性腦缺血一再 灌注損傷造成的腦梗死體積,起到神經保護的作用。 CK是一種細胞內酶,主要分布在骨骼肌,其次為 腦組織和心肌。研究認為,血清CK一樣可以作為腦 內神經細胞損害的特異性生化指標,當腦組織受到損 傷時,CK活力增加一。。本實驗結果濕示L—THP具有 降低局灶性腦缺血一再灌注大鼠血清CK活力的作用, 從生化角度間接反映L—THP對局灶性腦缺血再一灌注 損傷的腦組織具有保護作用。 Fas屬于腫瘤壞死因子受體家族成員,為凋亡刺激 因子,其配體是細胞凋亡因子FasL,Fas、FasL是凋亡誘 導家族的重要成員之一。Fas與FasL結合,可促發一 系列細胞內反應,最終導致靶細胞的Caspase激活,凋 亡細胞增多:6】。本實驗發現,腦缺血.再灌注損傷能夠 引起腑組織Fas、FasL的陽性細胞表達增多,應用L— THP40mg?kg。能夠下調局灶性缺血.再灌注損傷后 腦內Fas、FasL陽性細胞表達,減少局灶性腦缺血一再灌 注后神經細胞凋亡,這可能是其對腦缺血一再灌注損傷 保護機制之一。 腦缺血.再灌注損傷機制眾多,目前大量的研究認 為L—THP可減少全腦缺血一再灌注損傷后神經元的死 亡,對腦缺血一再灌注損傷具有一定的保護作用。可能 通過在缺血一再灌注早期增加ATP含量,減少乳酸產 生,降低神經元凋亡的發生"1;阻斷鈣通道,減少鈣超 載,抑制缺血.再灌注后腦組織鈣聚集博o;同時能夠通 過減少自由基產生、抑制炎癥反應【9。和減輕一氧化氮 (NO)介導的神經毒性¨毗等機制發揮對腦缺血.再灌 注損傷的腦保護作用。本實驗通過選擇局灶性腦缺 血一再灌注模型,在此基礎上觀察L—THP對腦缺血.再 灌注損傷后凋亡蛋白Fas、FasL的影響,發現L-THP可 通過抑制神經組織內凋亡蛋白Fas、FasL表達,減少細 胞凋亡的發生,從而改善局灶性腦缺血一再灌注損傷大 鼠腦梗死體積,降低CK活力,起到腦組織保護作用。 [DOI]10.3870/yydb.2010。09。001 [參考文獻] [1]李李,劉英,康相濤.主要凋亡基因對細胞凋亡的 調控[J].解剖科學進展,2007,13(1):62—65. 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