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    兔DCM造模及骨髓間充質干細胞培養方法學的研究
    關鍵字:方法,研究,培養,干細胞,yz,AB,CD,wx,uv,op 發布時間:2011-08-19

    基金項目: 哈爾濱市科技創新人才(優秀學科帶頭人)研究專項資金 No.2006RFXXS030教育部黑龍江省部共建心肌缺血機理 與診療技術重點實驗室 倡通訊作者 文章編號:1007-4287(2010)10-1539-04 兔DCM造模及骨髓間充質干細胞培養方法學的研究 孫 敏,姜雙全,田家瑋 倡 ,王旭東,何 寧 (哈爾濱醫科大學附屬第二醫院超聲醫學科,黑龍江哈爾濱150086) 摘要:目的 探討應用阿霉素制備兔擴張型心肌病(DCM)模型及兔骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離培養方法,旨 在為研究DCM治療方法的選擇以及臨床療效的觀察奠定基礎,為細胞移植的準備提供方法學依據。方法 應用1周 1次每次2mg/kg,及每周2次每次1mg/kg,均連續8周的給藥方式進行兔DCM模型的制備,給藥結束后3周處死動 物,行心肌組織病理學檢查比較其效果;分別應用密度梯度離心法及全骨髓培養法進行兔MSCs的體外分離培養,比 較其生物學特性。結果 心肌組織病理學檢查結果顯示,兩組動物心肌均呈DCM樣改變,模型制備效果一致,動物死 亡率和體重減輕率無統計學差異。應用密度梯度離心法和全骨髓培養法均可獲得MSCs,但所獲細胞純度及其生物學 特性略有差異。結論 本研究表明兔作為實驗動物經濟有效,兩種給藥方式模型制備效果一致,推薦使用1周1次的 給藥方式;兩種培養方法均可獲得MSCs細胞,可根據不同實驗中具體需要的細胞數量和細胞純度進行不同培養方法 的選擇。 關鍵詞:擴張型心肌病;動物模型;骨髓間充質干細胞;體外培養;兔 中圖分類號:R542.2文獻標識碼:A Methodologyofprepairingthedilatedcardiomyopathymodleinrabbitsandculturingthemesenchymalstemcellsisolated frombonemarrowofrabbit SUNMin,JIANGShuang-quan,TIANJia-wei,etal.(DepartmentofUltrosound,TheSecondAffili- atedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China) Abstract:Objective EstablishAdriamycin-induceddilatedcardiomyopathy(DCM)modleofrabbitsthroughear-bordervein andexplorethesuitablecultureconditionofrabbitmesenchymalstemcells(MSCs)forresearchingthecell-transplantationtherapyof DCM.Methods EstablishtheDCMmodlebytwowaysofadminister.Onewayisinjectingadriamycin2mg/kgbodywtonceper weekfor8weeks,andtheotherisinjectingadriamycin1mg/kgbodywttwiceaweekfor8weeks.Wecomparetheefficiencyoftwo methodsbypathologyresultafter3weeks.ThewholemedulloculturemethodandFicoll-Hypaquedensitygradientsolutionmethodwere usedtoisolateMSCs,andthenobservingthegrowthproperty.Results After3weeksoffinalinjection,thehistomorphologychangesof myocardiumcoincidedwiththecharacteristicsofDCM.Twowaysofadministeringhadthesameefficiency.Bythewholemedullocul- turemethod,cellnumberwegotwasgreaterthanthatthroughtheFicoll-Hypaquedensitygradientsolutionmethod,butthePuritywas worse.Conclusion TheDCMrabbitmodelwhichpreparedbytwowaysofadministeringwassimilartothehistopathologychangesof DCMinhumanandwesuggestthewayofadministeringbyonceaweek.WecanchoosethemethodofculturingtheMSCsbydifferent demandsofcellnumberandcellpurityindifferentexperiments. Keywords:dilatedcardiomyopathy;animalmodel;mesenchymalstemcell;culture;rabbit (ChinJLabDiagn,2010,14:1539) 擴張型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)是 心肌病變伴心功能障礙的一組疾病,動物模型制備 對于治療方法的選擇以及臨床療效觀察有著十分重 要的意義 [1,2]。 骨髓間充質干細胞(mesenchymal stemcells,MSCs)是存在于骨髓中的一種非造血干細 胞,具有強大的分化潛能,還可以進行跨胚層分化。 研究表明MSCs取材相對容易,體外培養擴增迅速, 異體移植無免疫排斥反應,已成為一種理想的細胞 工程學種子細胞。 1 材料與方法 1.1 研究對象 健康純種日本大耳白兔50只(購自哈爾濱醫科 大學附屬第二醫院動物實驗中心),雌雄不限,體質 量2.00kg-2.25kg,平均(2.03±0.25)kg,隨機分 為3組,A組20只,B組20只,對照組10只,各組動 物年齡體質量均無顯著性差異。 1.2 兔擴張型心肌病模型的制備 將注射用鹽酸阿霉素(多柔比星)用生理鹽水稀 —9351—皛  中國實驗診斷學 2010年10月 第14卷 第10期 換頁 釋成0.5mg/ml。A組,耳緣靜脈注射鹽酸阿霉素, 每周1次,每次2mg/kg;B組,耳緣靜脈注射鹽酸阿 霉素,每周2次,每次1mg/kg;對照組,注射等量生 理鹽水,均連續8周。A組和B組兩組注射鹽酸阿 霉素的總量相同,均為16mg/kg。為避免阿霉素對 心臟急性中毒作用的干擾,兩組動物均于用藥結束 后3周處死,取心肌行病理學檢查。 1.3 兔MSCs體外培養 1.3.1 密度梯度離心法 選取2月-2.5月齡大耳 白兔,體質量1.75kg-2.0kg,耳緣靜脈注射戊巴比 妥鈉麻醉,于無菌條件下使用注射器抽取5ml肝素 生理鹽水混合液,然后抽取兔雙側股骨骨髓共15 ml。將20ml肝素骨髓混合液平均分成4份注入離 心管,鋪于等量密度為1.077的淋巴細胞分離液上, 天平配平,2000r/min離心20min;液體分成4層, 吸取第2層乳白微透明液體層(包括其中粉紅色絮 狀物)平均置入兩個離心管中,加入PBS定容至10 ml,2000r/min離心5min;棄上清液再次加入PBS 定容至10ml,吸管吹打混勻,再次離心5min;棄上 清液,離心管底部白色細胞層即為MSCs。加入 DMEM/胎牛血清培養基(3-5ml),混勻細胞后吸入 培養瓶置入孵箱(溫度37℃,飽和濕度5%CO2)培 養。首次72h換液,以后每48h換液一次,操作中嚴 格無菌。首次換液時加入PBS沖洗2-3次,以后每 次換液均用PBS沖洗1-2次。待培養瓶中80%左 右細胞貼壁后即可傳代。首先吸出培養瓶中培養 液,加入PBS洗去殘留的培養液后吸出;然后加入 0.25%胰酶,顯微鏡下觀察,待細胞的長梭形結構變 圓、變亮后立即棄掉胰酶加入培養液終止消化;最后 吸取培養瓶中培養液,借助沖擊力吹打瓶底貼壁細 胞令其自瓶壁脫落,將細胞懸液平均置入兩個培養 瓶即可 [3]。 1.3.2 全骨髓培養法 選取1月齡大耳白兔,體質 量約為0.75kg-1.0kg,由于動物體重較小,可使用 水合氯醛腹腔注射麻醉,方法簡單易行,且較戊巴比 妥鈉安全。無菌條件下逐層切開分離出兔雙側股 骨,注意保持股骨干凈完整。將分離出的兩段股骨 放入培養皿中加入75%酒精浸泡,5分鐘后移入另 一無菌培養皿中,剪去兩端干骺端暴露骨髓腔,注射 器抽取10mlDMEM/胎牛血清培養基沖洗骨髓腔,并 將沖下的骨髓和培養基混勻。將培養基和骨髓的混 合物平均置入兩個培養瓶,孵箱中培養。首次48h 半量換液,即吸出原瓶內1/2的培養液,加入等量新 鮮培養液。再過48h后全量換液,操作中嚴格遵循 無菌原則。傳代方式同前。 2 結果 2.1 動物的一般情況 A組首次注藥后動物死亡1只,后于第5周至 第9周每周死亡1只,共存活動物14只,死亡率為 30%,體重減輕25%;B組,分別于第4周、5周、7周 各死亡1只,第8周死亡2只,共存活動物15只,死 亡率為25%,體重減輕27%;對照組于整個試驗過 程中無動物死亡,且體重增加13%。A組和B組動 物均出現掉毛,食欲減退,耳部感染,精神萎靡等情 況,對照組上述情況均無。A組與B組死亡率及體 重減輕率比較無統計學意義(P<0.05)。 2.2 組織形態學觀察 給藥結束后3周處死動物取其心臟,甲醛固定 HE染色。可見A、B組心肌細胞呈廣泛水腫和空泡 變性的改變,很多部分可見心肌脂肪變性或壞死,細 胞間質水腫,細胞間隙增寬,并可見少量炎性細胞浸 潤。對照組心肌細胞排列整齊,細胞間隙不寬,細胞 間質豐富且均勻,見圖 1。 注:圖左為對照組兔心肌切片,右圖為模型組兔心肌組織切片 圖1 心肌病理組織圖(HE×400) 2.3 細胞培養的一般情況 2.3.1 密度梯度離心法 首次換液后可以去除絕 大部分不貼壁的雜質細胞,只有少量懸浮的圓形雜 質細胞,可見呈螺旋狀、放射狀集落生長的梭形或紡 錘形的MSCs。根據細胞生長情況決定傳代時機。 傳代至第5代以后,細胞逐漸變得寬大畸形,增殖活 性亦減退,尤其當細胞濃度減低過多時更容易出現 細胞形態的改變。 2.3.2 全骨髓培養法 首次半量換液后可見瓶內 大量雜質細胞,培養液混濁。48h全量換液后仍有 較多雜質細胞,鏡下可見大量圓形懸浮細胞和雜質 團,也有大量的旋渦狀集落生長的紡錘形MSCs。一 —0451—皛  ChinJLabDiagn,October,2010,Vol14,No.10 換頁 艇澍鬟, 般于第2次換液后2日即可傳代。隨著換液次數增 多雜質細胞逐漸減少,最終可獲得較純凈的MSCs。 此法選用1月齡左右的日本大耳白兔,MSCs數量多 且生發能力較強,見圖 2。 注:圖左為密度梯度離心法首次換液后細胞狀態,圖右為全骨 髓培養法首次換液后細胞狀態 圖2 首次換液后細胞狀態 3 討論 擴張型心肌病是當前嚴重威脅人類健康的主要 心血管疾病之一,DCM動物模型是研究治療方法和 觀察療效的重要工具 [4-5] 。本研究結果表明兔作為 實驗動物經濟有效,經病理證實DCM模型確切。 MSCs在損傷組織的修復,尤其是不可再生細胞組織 的修復中起到了重要作用,細胞的數量和質量是基 礎。 3.1 兩種造模方法的比較 在進行DCM模型的制備過程中,分別采用了文 獻介紹的兩種造模方法,即A組每周給藥1次每次 2mg/kg,B組每周給藥2次每次1mg/kg,均持續8 周,總劑量一致。比較兩種給藥方式后,發現兩組動 物死亡率和體重減輕率無統計學意義,且動物的一 般狀況也無明顯差異。A組于首次注藥后有1只動 物死亡而B組無動物死亡,主要考慮與動物的個體 差異、急性過敏反應或氣體栓塞有關,而與給藥劑量 無關,因為無論是1mg/kg還是2mg/kg均為不會致 死的小劑量。兩組動物的心肌病理均呈DCM樣改 變,無明顯差別。考慮到阿霉素對給藥局部血管和 皮膚的損害作用,減少給藥時對動物造成的刺激影 響,推薦采用每周1次,每次2mg/kg的給藥方式。 3.2 兩種細胞培養方法的比較 目前對MSCs體外純化擴增的方法包括密度梯 度離心法,全骨髓培養法(又稱直接貼壁篩選法),流 式細胞分離法,免疫磁性分離法 [6-7]。 雖然流式細 胞分離法和免疫磁性分離法分離特異性較高,但由 于所需骨髓量較大,且儀器昂貴費用較高,本研究采 用密度梯度離心法和全骨髓培養法進行MSCs的體 外擴增。密度梯度離心法利用細胞密度不同的沉降 原理,用淋巴細胞分離液將紅細胞、白細胞和間充質 細胞有效的分離開,通過1-2次換液后即可獲得純 度較高的MSCs,且視野清晰觀察方便。但此法所需 骨髓量較全骨髓培養法大,操作步驟相對復雜,損失 細胞相對較多,最終獲得的細胞雖純度較高但數量 相對較少。全骨髓培養法利用血液中三系細胞均不 貼壁生長只有MSCs貼壁生長的特性,通過數次換 液除去不貼壁的雜質細胞,故又稱直接貼壁篩選法。 此法操作簡單,最初存在于培養液中的雜質細胞對 MSCs的生長無明顯抑制,所得細胞數量較多,縮短 了原代的生長周期。但此法需經多次換液后方可去 除雜質細胞,由于紅細胞沉積粘附于培養瓶底壁清 除困難,用吸管吹打清除的過程中可能損失部分尚 未牢固貼壁的MSCs。且由于漂浮的雜質細胞數量 較多,培養液混濁,視野不夠清晰,為觀察造成了一 定困難。首次半量換液就是希望可在早期去除部分 紅細胞,以減少在底壁的沉積粘著;同時由于雜質細 胞較多、細胞數量大,及時更換部分培養液可以保證 MSCs的營養供應。兩種方法最終均可獲得MSCs, 可根據不同實驗中具體需要的細胞數量和細胞純度 進行選擇。 體外培養MSCs易受血清濃度、貼壁時間、種植 密度、培養溫度等多種因素影響,尤其是傳代時的種 植密度直接影響了細胞的形態和增殖能力。接種密 度低會造成細胞生長緩慢變得寬大畸形,失去原有 的長梭形細胞形態;接種密度高細胞堆積生長,造成 接觸抑制,觀察時可見細胞界限不清。文獻報道多 采用1∶2的比例進行傳代,即1瓶平均分為2瓶,本 實驗中多采用1∶1.5的比例進行傳代,即1瓶分為1 瓶半或2瓶分為3瓶,以保證較高的細胞密度,細胞 分泌的細胞生長因子量多,確保獲得形態標準、增殖 能力較強的細胞。 結論,反復多次小劑量耳緣靜脈注射阿霉素的 累積心肌毒性作用,可以成功制備兔DCM模型;應 用密度梯度離心法和全骨髓培養法均可獲得MSCs, 為研究MSCs的進一步應用奠定基礎。 作者簡介:孫敏(1982-),女,碩士研究生,研究方向為心血 管疾病的超聲診斷。 參考文獻: [1]9RecchiaFA,LionettiV.AnimalModelsofDilatedCardiomyopathyfor —1451—皛  中國實驗診斷學 2010年10月 第14卷 第10期 換頁 TranslationResearch[J].VeterinaryResearchCommunications,2007,31 (Suppl.1):35. [2]金 波,施海明,朱 軍,等.兔擴張型心肌病模型的實驗研究 [J].實驗動物與比較醫學,2007,27(2):77. [3]裴瑛波.骨髓間充質干細胞分離培養和定向分化的研究現狀[J]. 中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(14):2775. [4]YasuhiroIkeda,JohnRoss.Modelsofdilatedcardiomyopathyinthemouse andthehamster[J].Moleculargenetics,2000,15:197. [5]禮廣森,任衛東,張 卓,等.阿霉素致兔早期心臟毒性模型的建 立及超聲評價[J].中國醫學影像技術,2006,22(4):548. [6]李艷菊,李 寧,胡亮杉,等.大鼠骨髓間充質干細胞體外培養方 法的改進[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(1):71. [7]王佳南,張曉剛,湯為學,等.大鼠骨髓間充質干細胞的原代培養 條件[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(14):2740. (收稿日期:2009-12-14) 文章編號:1007-4287(2010)10-1542-03 結核分枝桿菌km基因的突變情況分析 王金河 1 ,孫海林 2 ,李洪敏 1 ,梁建琴 1 ,馮士生 1 (1暢解放軍309醫院結研所結核二科,北京100091;2暢鄂爾多斯二院結核科) 摘要:目的 探討結核分枝桿菌km基因突變的情況。方法 通過傳統梯度藥敏試驗和聚合酶鏈反應-單鏈構象 多態性(PCR-SSCP)分析248株分枝桿菌臨床分離株耐藥情況和km基因的變化。結果 藥敏試驗耐藥率為32.7% (81/248),248株分枝桿菌臨床分離株的16SrDNASSCP電泳圖譜均與結核分枝桿菌標準株相同。81株耐卡那霉素分 離株中,24株(29.6%)km基因SSCP泳動異常。結論 其部分耐藥原因可能是由于T.M耐KM藥物的km基因突變所 致。 關鍵詞:結核分枝桿菌;卡那霉素;km基因 中圖分類號:R378.91 + 1文獻標識碼:A TheresearchoftherelatonshipbetweenKmgenemutationandthedrug-resistanceofM.tuberculosis WANGJin-he, SUNHai-lin,LIHong-min,etal.(TuberculosisResearchInstitute,309thHospitalofPLA,Beijing100091,China) Abstract:Objective TostudytherelationshipbetweenKmgenemutationandthedrug-resistantM.tuberculosis.Methods  Kanamycindrug-resistanceandKmgenemutationin248M.tuberculosisstrainsisolatedfromclinicalsputumspecimenswereanalyzed bytraditionaldrugsusceptibilitytestsandPCR-SSCP.Results Therateofdrugsusceptibilitytestswas32.7%(81/248).Theelec- trophoresisprofilesof16SrDNAPCR-SSCPindicatedthatthe248M.tuberculosisstrainswereaccordingtoM.TBstandardstrain.24 ofthe81kanamycindrug-resistantstrains(29.6%)displayedabnormalinPCR-SSCPprofiles.Conclusion Insomedegree,Kmgene mutationmaderesistancetokanamycinofM.tuberculosisstrains. Keywords:M.tuberculosis,kanamycin,Kmgene (ChinJLabDiagn,2010,14:1542) 當前,在治療MDR-TB的抗結核一線藥物大部 分已經耐藥 [1-4], 人們開始把目光轉向二線藥物的 應用。其中,使用比較多的藥物是卡那霉素(KM)。 現在常規藥物敏感試驗發現,臨床亦出現KM耐藥 的現象。傳統的結核菌藥敏試驗能初步反映結核分 枝桿菌耐KM的表面現象,但不能分析結核分枝桿 菌是否發生本質(km基因突變)的變化。本文運用 分子生物學方法,分析248株結核分枝桿菌臨床分 離株的藥敏和km基因突變情況,研究KM耐藥水平 和km基因之間的關系,尋找其內在的聯系。 1 材料與方法 1.1 菌種和菌株來源 結核分枝桿菌標準株來源 于中國藥品生物制品檢定所;248株結核分枝桿菌臨 床分離株來源于本院2006-2007結核科住院病人 臨床標本。 1.2 分枝桿菌培養、菌種鑒定和藥敏試驗 按“結 核病診斷細菌學檢驗規程”進行分枝桿菌BACTEC培 養、菌種鑒定和藥敏試驗。耐卡那霉素藥物濃度標 準:100μg/ml、10μg/ml和1μg/ml分別為高度、中、 低度耐藥 [5-7]。 1.3 細菌DNA的制備 采用本室自制的標本前處 理試劑盒提取DNA,即:取標本0.5~1ml,加入等體 積的1XTris.Hcl-EDTA液,加入消化液50μl,混均至 80℃水水浴30分鐘,每5分鐘混均1次,8000rpm 10分鐘,取上清1ml。向樣本內加入1ml平衡酚, 顛倒混勻數次,勿振蕩,8000rpm10分鐘,取上層水 —2451—皛  ChinJLabDiagn,October,2010,Vol14,No.10 換頁

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