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    乳腺癌組織中EMS1 mRNA檢測的臨床意義
    關鍵字:臨床,意義,檢測,組織,IJ,MN,GH,EF,AB,CD, 發布時間:2011-08-20

    第20卷第4期江蘇大學學報(醫學版) V01.20No.4 2010年7月 JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) July2010 乳腺癌組織中EMSlmRNA檢測的臨床意義 盛建1,徐青2,陳錦鵬2,何志賢2 (1.江蘇大學附屬人民醫院普通外科,江蘇鎮江212002;2.南通大學附屬醫院普通外科,江蘇南通226021) [摘要】目的:通過檢測EMSI基因在乳腺癌組織中的表達,結合乳腺癌分子分型及各項I臨床病理參數,分析 EMSImRNA表達水平在乳腺癌組織檢測中的臨床意義。方法:采用RT.PCR法檢測94例乳腺癌及癌旁組織EMSI mRNA相對含量,以乳腺癌癌旁組織EMSImRNA的相對表達鍍均值為界限,乳腺癌組織分為高表達組和低表達組; 采用ELIVISON二步法,對乳腺癌組織進行免疫組化分析并根據基因聚類分析進行分子分型;分析EMSl基因表達與 乳腺癌分子分型及各項臨床病理參數的關系。結果:乳腺癌組織與癌旁組織中EMSlmRNA平均表達水平為0.578 ±0.105和0.397±0.079,高表達率為60.6%(57/94)。Basal.1ike型乳腺癌中EMSI平均表達水平最高,與其他分子 分型比較,差異有統計學意義。EMSImRNA高表達與患者年齡>150歲、絕經后和腋淋巴結轉移成正相關,與腫瘤大 小、腫瘤分級和TNM分期狀況無關。結論:EMSl基因可能是乳腺癌的一種新預后指標。 【關鍵詞】乳腺癌;EMSI;逆轉錄-聚合酶鏈式反應;腋淋巴結轉移 [中圖分類號]R730.2;R737.9[文獻標志碼】A[文章編號]1671—7783(2010)04—0327—05 ExpressionandclinicalsignificanceofEMSlmRNAinbreast cancer SHENGJianl,XUQin92,CHENJin-pen92,HEZhi—xian2 (1.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople’sHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212,002;2.DepartmentofGeneral Sugery,theAffiliatedHospital ofNantongUniversity,NantongJiangsu226021.China) [Abstract]Objective:TodetecttheexpressionofEMSlgeneinbreast cancertissues,combiningthe moleculartypeandclinicopathologicalparameterstoevaluatetheclinicalsignificanceofEMSIexpressionin breastcancer.Methods:TheexpressionofEMSlWasdetectedbyRT?PCRinsurgicalneoplasticandpara- neoplasticbreasttissuesfrom94 casesofbreastcancerpatients.TheER,PR,Her2/neu,EGFRstatusWas detectedafteroperationbyELIVISONtwo-stepimmunohistochemistrymethodandaccordingtogeneexpres- sionclusteringanalyzebreastcancermoleculartype,breastcancertissuesweredividedintoEMSlmRNA highexpressiongroupandlowexpressiongroupbased ontheaveragevalueofallparaneoplasticbreasttis? suesandthecorrelationbetweenEMSI geneexpression,themoleculartypeandclinicopatholo西calparame— tersofbreastcancerwasanalyzed.Results:TheaverageexpressionleveloftheEMSlmRNAWas0.578± 0.105and0.397±0.079inallneoplasticandparaneoplasticbreasttissues,and60.6%(57/94)ofallhe- oplastic caseswasEMSImRNAhighexpression.EMSIaverageexpressioninthebasal-likecarcinomaofthe breastwasthehighestthanthefourothermoleculartypesandhadsignificantdifference.Thehishexpres— sionofEMSlmRNAWaspositivelycorrelatedwithage≥50,postmenopausalstatus,axillarylymphnodes metastasis.TheexpressionofEMSImRNAWasindependenceoftumorsize,tumorgradeandTNMstage. Conclusion:EMSI genemaybe anewprognosisfactorofbreastcancer. [Keywords] breastcancer;EMSl;RT—PCR;axillarylymphnodesmetastasis EMSl基因是由Sehuuring等‘11于1992年通過 eDNA克隆序列分析發現的一種新的基因,與細胞 胞突形成有關,其編碼蛋白為細胞皮質區肌動蛋白 結合蛋白(corticalaetinbindingprotein,Cortactin), [作者簡介]盛建(1979一).男,主治醫師,碩士.主要從事甲狀腺、乳腺疾病的臨床研究;徐青(通訊作者),教授。碩士生導師,E-mail: sj05817@126.oom 萬方數據 換頁 328 江蘇大學學報(醫學版)第20卷 能通過氨基末端結合并活化肌動蛋白相關蛋白2/3 (Arp2/3)復合物,來調節肌動蛋白的動力;而羧基 末端則在肌動蛋白多聚化中起關鍵作用,能顯著增 強上皮細胞的運動遷移能力,與腫瘤細胞侵襲、轉移 有關[2]。本實驗通過RT-PCR法對94例乳腺癌組 織及癌旁組織中EMSImRNA表達情況進行研究, 結合乳腺癌分子分型及各項臨床病理學檢測結果, 分析EMSImRNA表達水平在乳腺癌組織中的臨床 意義。 1資料與方法 1.1臨床資料 94例女性乳腺癌為南通大學附屬醫院普外科 2007年2月至2008年1月收治的患者。年齡在24 ~87歲之間,平均年齡58.4歲,t>50歲者62例,絕 經者54例,61例腫塊直徑i>2em。病理分型、組織 學分級、淋巴結轉移狀況等均以術后病理報告為準。 患者術前均未進行化療或放療,其中行乳腺癌改良 根治術79例,根治術13例,擴大根治術2例。術后 病理證實腋窩淋巴結轉移者給予化療,腋窩淋巴結 轉移超過3枚者加做放療,雌激素受體(estrogen re. eeptor,ER)陽性者給予他莫昔芬口服5年,或者ER 陽性且絕經者使用第三代芳香化酶抑制劑進行內分 泌治療。 1.2EMSlmRNA半定量檢測 1.2.1標本收集及處理94例乳腺癌及癌旁組織 標本均在手術時收集,離體后切取新鮮無壞死組織 立即投入一196℃液氮速凍,lh后移至一70℃深凍 冰箱中保存備用。 1.2.2總RNA提取取100mg組織,采取Tfizol 一步法提取總RNA,將RNA溶于無RNA酶純水中, 紫外分光光度計定量并鑒定RNA的純度,RNA電 泳判斷抽提RNA的質量。 1.2.3RT反應按照試劑盒說明進行,依次取2 斗g總RNA、OligodT(18)(0.5“g/山)1一、DEPC水 補至總體積12一,混勻后70℃孵育5min;依次加 入5×反應緩沖液4山、Rnase抑制劑(20U/p,1)1 出、10mmoL/LdNTP2山后,37℃孵育5rain;冰上 冷卻后,加入M—MULV反轉錄酶(200U/山)l一 至20山反轉錄體系,于42℃孵育60min,70℃孵育 10rain,冰上冷卻后,一20℃保存。 1.2.4PCR反應取20一反應體系中逆轉錄產 生的cDNA模板2.0一,10×PCR緩沖液5一,dNTP (10mmol/L)2山,腳酶1.5U,EMSl及GAPDH 引物(上、下游)各1一,MgCl2(25mmolfL)3山和 滅活Rnase的雙蒸水補足體積至50山,于PCR擴 增儀上經94℃預變性5rain,94℃變性458,56℃退 火45s,72℃復性1min,30個循環,最后72℃延伸 10min。產品及引物由上海生工有限公司合成提 供。EMSI引物參考文獻[3]:正義:5’一TCCCAATC— CAGAGACCCG-3’;反義:5’-TCCCCTGATGCCCAG- GTC-3’,擴增EMSI基因片斷,共113bp。以細胞內 表達恒定的人GAPDH作為內參照。根據基因庫中 GAPDHcDNA序列,由引物設計軟件PrimePremier 5.0設計目的基因,擴增片段全長215bp。引物為 正義:5’-CCTTCATTGACCTCAACTACATG一3’;反義: 5’一CTYCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。 1.2.5PCR產物相對定量分析取lO仙lPCR產 物加入2斗l6×加載緩沖液,經2%瓊脂糖凝膠水 平電泳,溴化乙啶染色,紫外燈下觀測。存人Dol— phin-ld凝膠成像分析系統,測量電泳帶的光密度 值。結果判定:PCR產物量以光密度×面積來表 達,以目的基因EMSl的PCR產物量與GAPDH產 物量的比值代表目的基因的相對表達量。以癌旁 組織EMSImRNA的相對表達量均值為界限,將癌 組織分為EMSlmRNA高表達和低表達組,計算高 表達率。 1.3ER、PR、Her2/neu、EGFR蛋白表達的檢測 術后常規對乳腺癌組織進行免疫組化分析,采 用LABVISION2D全自動免疫組化染色儀,ELIVI. SON二步法進行染色,檢測ER、PR、Her2/neu、EG- FR的表達。ER、PR蛋白染色顆粒位于胞核內,陽 性結果為胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒;Her2/neu染 色顆粒位于胞膜,胞膜染色為陽性細胞;EGFR蛋白 染色顆粒位于胞質內,陽性結果為胞質內呈棕黃色 顆粒。染色半定量分級標準:每張切片選5個高倍 視野(200倍),按腫瘤陽性細胞率和著色強度分別 進行計分:①按陽性細胞百分率,O分為≤5%,1分 為6%一25%,2分為26%一50%,3分為5l%^: 75%,4分為>75%;②按著色計分:分為4個等級, 0分為無著色,1分為淡黃色,2分為黃色,3分為棕 黃色。兩者的乘積:O分為(一),1—4分為(+), 5—8分為(++),9—12分為(+++)。統計時, (一)及(+)表達作為陰性組;(++)及(+++)表 達作為陽性組。 1.4統計學方法 使用SPSSl3.0統計軟件進行統計分析。計數 資料采用Pearson卡方檢驗,卡方檢驗有相關性的, 萬方數據 換頁 第4期盛建,等.乳腺癌組織中EMSImRNA檢測的臨床意義329 行Spearman等級相關分析。方差齊性及多樣本均 數比較采用F檢驗,數據用i±s表示。檢驗水準為 0.05。 2結果 2.I乳腺癌和配對癌旁正常組織中EMSImRNA 的表達水平 乳腺癌及配對癌旁正常組織均表達EMSI,服 從正態分布,且方差齊。94例乳腺癌組織中,EMSI mRNA表達的相對光密度值為0.578±0.105;癌旁 組織為0.397-1-0.079。乳腺癌組織EMSImRNA表 達均值明顯高于癌旁組織,兩者比較差異有統計學 意義(P<0.01)。但由于癌組織與癌旁組織EMSI mRNA表達的相對光密度值范圍部分重疊,少數癌 組織EMSImRNA相對光密度值可略低于癌旁組 織,如33號標本(圖l,T表示腫瘤組織,N為其癌旁 正常對照)。以EMSlmRNA表達均值0.397為界。 將乳腺癌組織EMSImRNA表達分為高表達和低表 達,本組94例乳腺癌患者中有57例患者高表達,高 表達率為60.6%(圖2,T19/T27/T52/T68為高表 達,T1I/T44/T75為低表達)。 M:標準參照物;T:腫瘤組織;N:瘤旁組織 圖1乳腺癌及配對癌旁正常組織中EMSImRNA表達 rigl EMSImRNAexpressionlevelsinbreastcancer andpairednormaltissues M:標準參照物;T:腫瘤組織 圖2乳腺癌組織中EMSImRNA表達 rig2EMSImRNAexpressionlevelsinbreastain.t 2.2 EMSImRNA表達與乳腺癌臨床病理參數的 關系 EMSImRNA高表達與年齡>150歲、絕經后、腋 淋巴結轉移成正相關,相關度R分別為0.248, 0.275和0.213;而與腫瘤大小、分級水平、TNM分期 無關(表1)。 表l EMSImRNA表達與乳腺癌臨床病理參數的關系 Tabl Relationshipbetw∞nEMSlmRNAexpression andelincopathologicalfeatures 凳篡群3757,…(例)(例) a:Pearson卡方檢驗.b:Spearman等級相關分析 2.3 EMSImRNA表達與乳腺癌分子分型的關系 免疫組化結果見圖3。根據免疫組化結果,運 用Perou等一。和Sorlie等[51提出的基因表達聚類分 析,將94例乳腺癌組織按分子分型分為5種不同的 亞型:luminalA型,luminalB型,HER2過表達型, basal-like型和normalbreast—like型。分別檢測 EMSl表達水平(表2)。LuminalA型中EMSI平均 表達水平最低,而basal.1ike型中EMSl平均表達水 平最高;兩者EMSI平均表達水平與其余4型比較, 差異均有統計學意義(P<0.05)。 3討論 EMSl/Cortactin促進腫瘤轉移的具體作用機 制,目前尚不十分清楚。Kurebayashi等。6o發現,Cot- tactin通過加強與內皮細胞的相互作用,促進腫瘤細 胞骨轉移,可能是Cortactin促進腫瘤細胞侵襲轉移 的機制之一。有研究表明,Cortactin過表達通過促進 E—selectin介導的細胞間黏附連接的形成和細胞骨架 萬方數據 換頁 330 江蘇大學學報(醫學版)第20卷 圖3免疫組化陰性及陽性結果(ELIVISON法,X400) Fig3 Immunohistochemicalnegativeandpositiveresults(ELIVISONmethod,x400) 表2EMSImRNA表達與乳腺癌分子分型的關系 Tab2 RelationshipbetweenEMSlmRNAexpressionandthemoleculartype a:與luminalA型比較;b:與basal-like型比較 的重組,可能是Cortactin促進腫瘤細胞侵襲與轉移 的機制之一"J。EMSl/Cortactin過表達通過細胞外 信號調節激酶和/或AKT(蛋白激酶B),提高血清 和表皮生長因子介導的細胞增殖,并抑制腫瘤細胞 的失巢凋亡18】。Luo等一1研究發現,EMSl/Cortactin 可能通過P13Kinase/Akt信號途徑抑制腫瘤細胞的 失巢凋亡。 腋淋巴結轉移是判斷乳腺癌患者預后重要的指 標,同時也是腫瘤分期及選擇治療方案的重要依據, 乳腺癌患者生存率隨著陽性淋巴結數目的增多而遞 減。10‘11]。本次研究我們發現,EMSl基因高表達與 乳腺癌患者年齡≥50歲、絕經后、腋淋巴結轉移正 相關。提示在年齡>150歲和(或)絕經后的乳腺癌 患者中,腋淋巴結轉移可能與EMSI基因高表達有 關。因此,測定EMSl表達狀況對判斷乳腺癌患者 的治療方式的選擇及預后判斷可能有指導意義。 乳腺癌的分子分型能很好地反映其生物學行 為,明確其個體分子特征,不僅有助于判斷預后, 還有助于預測乳腺癌對臨床治療的反應,是實現個 體化治療的基礎。采用基因芯片技術對乳腺癌進行 基因表達譜分析是鑒定各種分子亞型最有效的工 具。但該技術對標本的要求較高,且費用昂貴,實 際操作困難,較難在臨床廣泛應用;乳腺癌各分子 亞型均有蛋白質標志物如ER,PR,HER-2,CKS/ 6,EGFR等的明顯差異,所以大多數研究應用免疫 組織化學技術替代基因芯片技術在蛋白質水平上對 乳腺癌進行分子分型。雖然乳腺癌的異質性使得免 疫組織化學技術的分子分型和基因芯片技術的結果 不完全一致,但前者也基本反映了各分子亞型的臨 床特征,目前被廣泛采用。通過對EMSI在本組乳 腺癌各分子分型中表達狀況的檢測,我們發現,lu. minalA型中EMSl平均表達水平最低;而basal.1ike 型中EMSI平均表達水平最高,較其他分子分型有 顯著差異,提示在basal—like型乳腺癌中,EMSl高表 達可能是促進該型腫瘤早期復發轉移的重要因素 之一。 合理使用分子靶向藥物能顯著提高乳腺癌各亞 型的治療效果。luminalA型HER2一,內分泌治療 效果明顯優于luminalB型,但對化療不敏感。Iu— minalB型HER2+,對他莫昔芬耐藥,但對芳香化 酶抑制劑敏感。HER2過表達型ER-且PR.,故內分 泌治療效果差;但含有蒽環類的化療方案以及抗 HER2的靶向治療藥物赫賽汀的應用可以顯著改善 其預后¨2。¨1。Normalbreastlike型對化療最不敏 萬方數據 換頁 第4期盛建,等.乳腺癌組織中EMSImRNA檢測的I|;}i床意義 33l 感,basallike型乳腺癌ER,PR和HER2均為陰性, 內分泌治療和赫賽汀對其均無效。此型雖然對化療 有較高的敏感性,但在所有分子亞型中其預后仍是 最差的,其靶向基因仍不明確,因此尋找新的靶向藥 物是治療此型患者的關鍵。 研究發現,ADP核糖基化因子(Arf6)在乳腺癌 的侵襲中起關鍵的作用。AMAPl蛋白是GTP-Arf6 的效應分子,它的表達與浸潤性乳腺癌高度相關。 AMAPl與Cortactin、樁蛋白結合形成三聚體復合物 而發揮作用。在復合物中,AMAPl通過Cortactin的 脯氨酸富集區與其SH3區呈1:2結合。進一步的 研究發現,從AMAPI中衍生出的一種細胞滲透性 多肽能特異性阻抑Cortactin與AMAPI結合,從而 有效地抑制了乳腺癌細胞的浸潤與轉移。同時還發 現,抑制Cortactin的SH3區與脯氨酸富集區結合的 抑制劑UCSl5A,能有效阻抑Cortactin與AMAPl結 合,從而抑制乳腺癌細胞的浸潤與轉移。結合超微 結構分析,正常乳腺上皮細胞未發現Cortactin/ AMAPl復合物。Cortactin的SH3區很可能是乳腺 癌藥物治療的靶位點|1引。因此,我們認為,針對 CortactinSH3區的單克隆抗體對于內分泌治療及赫 賽汀治療效果不佳的乳腺癌患者,尤其是basallike 型乳腺癌,可能是一條新的治療途徑。 惡性腫瘤的發生、發展、浸潤與轉移是多基因多 因素共同作用的結果,對腫瘤相關基因的研究有利 于闡明其發生、發展及浸潤轉移的機制,同時為臨床 早期診斷、綜合治療及預后判斷提供依據。目前,對 于EMSl/Cortactin的結構、作用以及分子生物學機 制尚未完全闡明,需要進一步的研究與完善;其對于 臨床的診斷、治療及預后判斷,尚需要進一步的大樣 本量統計分析。 [參考文獻] [2] [3] SehuuringE,VerhoevenE,MooiWJ,eta1.Identifica- tionandcloningoftwooverexpressedgenes,U21B31/ PRADlandEMS!,withintheamplifiedchromosome 1lq13regioninhumancarcinomas[J].Oncogene, 1992.7(2):355—361. 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