<blockquote id="ykis2"></blockquote>
<input id="ykis2"></input>
  • <blockquote id="ykis2"></blockquote>
  • <samp id="ykis2"></samp>
    <menu id="ykis2"><input id="ykis2"></input></menu>
  • <menu id="ykis2"></menu>
  • <samp id="ykis2"><s id="ykis2"></s></samp>
    論文分類>>論文庫首頁 | MBA論文 | MPA論文 | 教育碩士論文 | 法律碩士論文 | 工程碩士論文
     
    當前位置:主頁 > 碩士論文庫 > 工程碩士 > 生物醫學工程 > 文章內容

    大鼠脫細胞脊髓的形態學觀察
    關鍵字:觀察,細胞,EF,GH,CD,AB,wx,yz,IJ,KL, 發布時間:2011-08-21

    754 中國脊柱脊髓雜志2010年第20卷第9期ChineseJournalof印ineand卻irudCord.2010,V01.20.M.9 大鼠脫細胞脊髓的形態學觀察 李宏波1,李萬里2,池永龍1,李玉麗3 (1溫州醫學院附屬第二醫院脊柱外科325027溫州市;2浙江大學醫學院附屬第二醫院骨科310009杭州市; 3溫州醫學院生物醫學丁程研究院325027溫州市) 【摘要】目的:觀察大鼠脫細胞脊髓的形態特點.探討其作為脊髓組織J二程支架的可行性。方法:取1l條SD大 鼠脊髓.采用凍融+化學萃取法進行脫細胞處理.其中2條采用HE染色觀察脫細胞情況.立春紅2R一亮綠SF 染色觀察脫髓鞘情況;3條取頸、胸、腰段橫切片行Malloryi色膠原染色和透射電鏡檢查,3條取頒、胸、腰段 縱切片行Malloryj色膠原染色.3條取頸、胸、腰段貼片行掃描電鏡檢查,觀察其形態構成等參數,比較不問部 位材料內部結構的差異.結果:經脫細胞處理的脊髓呈乳白色扁長條狀,十燥,體積較處理前略變小,韌性及強 度增加,表面脊膜包裹完好。無異味二HE染色顯示脊髓內未見細胞殘留;麗春紅2R一亮綠SF染色證實神經細 胞軸突脫髓鞘完全。頸、胸及腰段脊髓橫斷面均呈網格狀結構,縱斷面均呈平行管狀結構:頸、胸及腰段橫斷面 網格大小及縱斷面平行管狀結構I’HJ距行統計學兩兩比較,頸段網格長徑明顯大于胸段(P<0.05).胸段網格短徑 明屁小于腰段(肚0.05)。其余均無統計學差異(P>0.05):結論:SD大鼠脊髓經脫細胞處理后頸、胸和腰段脫細 胞徹底,保留r原脊髓的主體結構,可作為脊髓組織下程的支架。 【關鍵詞】脊髓損傷;組織丁程;脫細胞脊髓支架;大鼠 doi:10.3969/j.issn.1004--406X.2010.09.14 中圖分類號:R318.5。R683.2文獻標識碼:A文章編號:1004銣6X(2010)一09—0754—05 Morphologystudyofdecellularizedratspinalcord/LlHongbo,LIWanli。CHIYonglongl,etal//Chinese JournalofSpineandSpinalCord,2010,20(9):754-758 【Abstract】Objective:Toobservatethemorphologyof ratdecellularizedspinalcordandtoinvestigatetheits feasibilityofworking asspinalcordtissueengineeringscaffolds.Method:ElevenSDratspinalcordsadopt wereprocessedbythemethodoffreeze-thawandchemicallyextractedforthepreparationofdecellularized anddemyelinatingspinalcordscaffoldmaterial.TwoscaffoldmaterialswereprocessedforHE stainingtoob— serveaeellularandPonceauRed2R——BrilliantGreenSFstainingtoobservedemyelinating.3cross-sectional specimensfromcervical.thoracicandlumbarsections werestainedbyMallorytrichromecollagenandobserved undertransmissionelectronmicroscope.3longitudinalspecimensfromcervical,thoracicandlumbarsections werestainedbyMallorytrichromecollagen,and3specimensfromcervical,thoracicandlumbarsectionswere observedundertransmissionelectronmicroscope.Theirmorphologyandinnerstructureofvariedsitewere,ob? servedandcompared.Result:Thedecellularizedspinalcord wascreamcoloranddisplayedfiatlongstrip.with thefeaturesofdry.slightlydecreasedvolumeandincreasedflexibilityandstrength。ithadcompletesuperficiM duramaterandnounusualsmell.HEstainingindicatednocellinthespinalcord;PonceauRed2R-Brilliant GreenSFstainingshowedcompletedemyelination.Cross-sectionspecimenpresentedwithgridstructureincer- vieal。thoracicandlumbarspinalcord.andlongitudinalspecimenpresentedwithparallel—tubestructure.The gridsizeandlongitudinaldistancebetweentheparalleltubeofcervical,thoracicandlumbarspecimen were comparedmutually.theresultsshowedlongerdiameterofcervical咖dthanthoracicones(P<0.05),andthe shortdiameteroflumbargridlargerthanthoracicogles(只=o.05).whilenosignificanceremainedfortherest. Conclusion:Afterrelativemanagement,spinalcordofcervical,thoracicandlumbarpresentwithcompletede- cellularization.themainstructureoftheoriginalspinalcordsareretained.whichisapttobeused夠spinal cordtissueengineeringscaffold. 【Keywords】Spinalcordinjury;Tissueengineering;Decellularizedspinalcord;Rat 基金項目:浙汀省自然基金項日(編號:Y2080507)及浙江省衛生廳課題(編號:2007A140) 第一作者簡介:男(1982一),在讀碩上研究生.住院醫師.研究方向:脊柱外科 電話:(0577)88879034E-mail:lihongb024@163.uom通訊作者:李萬里E-mail:liwanli99@126.COlll 萬方數據 換頁 中同脊柱脊髓雜志2010年第20卷第9期 c^iMsP如Ⅱm耐∥卻i船rwf卻i加fco一.2010,Vd.20,Ⅳo.9755 【Author’sadd他鶴】DepartmentofSpineSu唱ery,SecondAmliatedHospital“WeTlzhouMedicalCollege, Wemhou。325027,Chi∞ 組織T程研究結果表明.生物支架材料及其 特定的形態結構對于損傷脊髓的修復效果具有至 關重要的作用…21。目前應用的組織工程支架材料 在物理性能、生物性能及形態結構上與正常脊髓 相比仍具有較大的差距,目前尚無與脊髓結構高 度相似且在理化性能也與脊髓相似的支架材料。 本研究采用郭樹章等l,I的凍融+化學萃取法對大 鼠脊髓進行脫細胞處理。觀察脫細胞脊髓的形態 特征.探討不同節段的脫細胞脊髓材料能否作為 脊髓組織工程的支架。 l材料與方法 1.1實驗動物和器材 SD大鼠(溫州醫學院動物實驗中心),麗春紅 2R、亮綠SF、脫氧膽酸鈉(溫州金山化學試劑有限 公司),脫氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶 (RNase)(北京索萊寶科技有限公司),一80℃深低 溫冰箱、恒溫回旋振蕩器及冷凍十燥機(溫州醫學 院附屬第二醫院中心實驗室),掃描電鏡、透射電 鏡(溫州醫學院基礎學院實驗室)。 1.2脊髓脫細胞處理 11只2月齡雄性SD大鼠.重約200。2509. 每只用1.0~1.5“水合氯醛腹腔注射麻醉,背部 去毛,取后正中切口.打開椎板,顯露并小心取出 脊髓。用PBS清洗去除表面血跡,參照郭樹章等【31 方法對脊髓進行脫細胞處理:將脊髓置于一80℃深 低溫冰箱中凍存lh。室溫下解凍后置于蒸餾水 內.在室溫下浸泡6h,每2h換液1次。然后置于 3%的脫氧膽酸鈉鹽蒸餾水溶液(加入適量lmoFL NaOH至溶液pH值為8-9),連續震蕩4h(恒溫回 旋振蕩器內持續振蕩,25℃,100dmin),再于蒸餾 水中浸泡振蕩3h(震蕩條件同前),lh換液1次, 置于IKU/“DNase和RNase混合液中持續振蕩 30rain.在蒸餾水中浸泡3h.1h換液1次,自置于 脫氧膽酸鈉鹽蒸餾水溶液開始按上述操作再萃取 1遍。將萃取后的脊髓組織置于冷凍干燥機凍干。 環氧乙烷徹底消毒.一80℃冰箱保存。 1.3脫細胞脊髓的觀察 1.3.1大體觀察 觀察脊髓的形狀、大小、顏色。 表面情況。有無異味,韌性及硬度等。 1.3.2組織學檢查隨機選取2條脊髓,用10% 福爾馬林液固定,常規石蠟包埋。其中1條隨機選 取一部位行連續組織化學橫切片.于另1條相應 部位行連續組織化學縱切片,片厚5¨m。每隔5 張切片取1張,共取5張切片。取橫切片和縱切片 進行HE染色,光鏡下觀察脊髓脫細胞情況,細胞 胞核和胞質應分別呈藍色和紅色。。 立春紅2R一亮綠SF染色:每隔5張切片取1 張,共取5張切片。取橫切片和縱切片。用麗春紅 2R染液(麗春紅2R1.Og。冰醋酸2.5ml,蒸餾水 97.5m1)染色3-5rain。蒸餾水洗。1%磷鎢酸水溶液 處理lmin后,亮綠SF染液(亮綠SF1.09,冰醋 酸lIIll,蒸餾水99m1)進行復染4rain,用1%冰醋 酸水溶液分化10s,蒸餾水洗,梯度酒精脫水,二 甲苯透明.中性樹膠封固。光鏡下觀察脊髓脫神經 髓鞘情況.脊髓自質中神經纖維束軸索和髓鞘呈 橙紅色,而灰質背景則呈淡綠色,神經元呈綠色。 1.3.3脫細胞脊髓不同部位內部結構比較剩余 9條脊髓用10%福爾馬林液固定.常規石蠟包埋。 先取3條.分別在頸、胸及腰段行連續組織化學和 透射電鏡橫切片。于另外3條材料相應3個部位 分別行連續組織化學縱切片。組織化學切片片厚 5“m,透射電鏡超薄切片片厚50nm。每條脊髓每 個部位每隔5張連續切片取l張,每種檢測取5 張切片。組織化學橫切片和縱切片行MalloDr三色 膠原染色:于0.5%酸性復紅水溶液染色1rain,蒸 餾水漂洗后,染色l~2rain(苯胺藍O.59、桔黃G 2.09、磷鎢酸1.09、蒸餾水100“)。蒸餾水漂洗后, 95%酒精分色,梯度酒精脫水。二甲苯透明,中性 樹膠封固.在光學顯微鏡下觀察i段脊髓橫斷面 和縱斷面的膠原保存情況及形態。透射電鏡橫切 片觀察三段形態結構及測量網格孑L徑大小。網格 孔徑大小按圖中標尺進行測量。再于剩余3條脊 髓相應3個部位用凍干折斷法分別獲得脊髓標本 的5個自然斷面的貼片。每個部位取5個貼片,用 掃描電鏡觀察其形態構成,按圖中標尺測量縱斷 面平行管狀結構間距。 1.4統計學處理 頸、胸、腰三段數據用平均數±標準差表示, 應用SPSS16.0統計學軟件進行統計學分析,不 萬方數據 換頁 756 中國脊柱脊髓雜志2010年第20卷第9期ChineseJournalofspineandspinalCord.2010.V01.20。ⅣD.9 同部位均數的兩兩比較采用t檢驗.P≤0.05為有 統計學差異。 2結果 在脫細胞蒸餾水浸泡過程中可見大量白色絮 狀物自脊髓內析出。脫細胞處理的脊髓經冷凍干 燥機凍干后呈乳白色扁長條狀.干燥.體積較處理 前變小,韌性及強度略增加.表面仍由脊膜包裹。 無異味(圖1)。在脫細胞處理后。脊髓切片HE染 色結果顯示無細胞成分存在(圖2);麗春紅2R一 亮綠SF染色后,脊髓橫、縱斷面均呈藍綠色背 景,無橙紅色髓鞘成分(圖3)。 Mallory三色膠原染色結果顯示。脊髓頸、胸 及腰段橫斷面均呈網格狀結構(圖4),縱斷面均 呈平行管狀結構(圖5)。超薄切片透射電鏡檢查 結果與Mallory三色膠原染色法基本相似。三段橫 斷面仍然為網格狀結構(圖6),掃描電鏡結果顯 示三段縱斷面為平行管狀結構(圖7)。頸、胸和腰 段的網孔長、短徑和平行管狀結構間距見表1,頸 段網格長徑與胸段比較有顯著性差異(P<0.05), 胸段網格短徑與腰段比較有顯著性差異(P= 0.05)。頸段網格短徑與胸段比較、胸段網格長徑 與腰段比較及頸段網格長、短徑與腰段比較均無 顯著性差異(P>0.05),說明網格孑L徑頸、腰段較 大,胸段較小。頸、胸和腰段縱斷面平行管狀結構 間距兩兩比較均無顯著性差異(尸>0.05)。 3討論 SCI的治療是當今脊柱外科研究的難點和熱 點領域之一。SCl分為原發性損傷和繼發性損傷, 原發性損傷一旦發生不可避免,而繼發性損傷在 一定干預下可減輕或者避免,因此阻止或減少繼 發性損傷是治療的關鍵。針對繼發性損傷的發生 機制.目前治療SCI的方法包括藥物治療、高壓氧 圖l大鼠脫細胞脊髓長3.04.Ocm,直徑2.0—2.5ram;兩 側可見斷裂神經根,尾部逐漸變細,并可見馬尾結構 治療、傳統手術治療等。雖然這些治療方法均可取 得一定療效.但卻仍不令人滿意。隨著組織工程技 術的不斷發展.采用組織工程方法治療SCI顯示 出令人欣喜的前景。組織工程要素有二,即支架和 種子細胞。支架應該符合一定的要求。SCI處植入 的支架應該提供一定立體結構.能為神經元及其 軸突以及復合的種子細胞生長提供限定的空間, 防止外界其他活性成分的干擾,指引神經元軸突 延伸,使新形成的組織接近于原有的解剖結構,有 利于功能性連接的建立。充填的支架材料還應該 能防止膠質瘢痕的形成.引導細胞及軸突生長形 成類似于正常解剖結構的組織.為中樞神經功能 恢復建立基礎。如果單純進行細胞移植治療而沒 有有效的支撐.細胞生長缺乏攀爬的支架,加之周 圍膠質瘢痕的長入阻礙.神經軸突無法充分延伸 與周圍正常組織形成突觸。而應用組織工程治療 能顯著改善這一情況.并且示蹤顯示其新生的組 織與周圍正常神經組織存在軸突連接I圳。無毒、不 引起細胞突變和不良組織反應.與脊髓結構性質 近似.組織相容性好.不引起排斥反應。在體內較 穩定.一段時間內能保持好的外形.是對組織工程 學中應用材料的基本要求。目前常用的可用于修 復SCI的材料主要有不可降解材料、可降解材料、 二者復合材料、納米高分子材料以及生物材料的 結構形式等。雖然這些材料用于組織工程各有其 可取之處。由于脊髓組織本身在結構、功能上的特 殊性、復雜性,均未能很好地模仿脊髓組織,修復 效果也有限。組織工程研究表明細胞外基質不僅 對組織細胞具有支持作用15l。而且細胞外基質中 所含的膠原、蛋白多糖、黏附分子及細胞因子等成 分還可影響細胞形態,調控細胞的代謝、遷移、增 殖、分化及信息傳遞㈦7】。因此,采用適當形式的細 胞外支架材料有望改善細胞移植后的局部微環境 狀態.從而對移植效果產生積極影響。脫細胞基質 即具有細胞外基質的上述作用。作為組織工程支 架具有與組織相似的結構,從而找到了一個解決 仿制脊髓組織結構困難的途徑。脫細胞技術在周 圍神經、皮膚、心肌、心瓣膜、膀胱等方面已得到了 廣泛的應用并取得了較好的效果,技術已經相對 成熟。郭樹章等在此基礎上率先采用凍融+化學 萃取的方法制備了脫細胞脊髓支架,并經過驗證 證實脫細胞脊髓支架具有與脊髓相似的結構.層 黏連蛋白、纖維連接蛋白等細胞外基質成分得到 萬方數據 換頁 中國脊柱脊髓雜志2010年第20卷第9期 ChineseJournalofspira,andspinalCord,2010,V01.20.No.9 757 保留Esl,脫細胞脊髓支架只引起輕微的免疫排斥 反應和炎癥反應[91。尹文化等fjfw亦證實機械振蕩有 利于清除脊髓內細胞、軸突和髓鞘,合適的機械振 蕩頻率在去細胞的同時.還能較好地保存脊髓內 天然的基質纖維和空間結構。 本研究按照郭樹章等引的方法,成功制成了 脫細胞脊髓材料。通過HE染色、立春紅2R一亮綠 SF染色證實脊髓脫細胞、脫髓鞘徹底。選用頸、 胸、腰=三段脊髓分別制成橫、縱兩個斷面。采用 Mallory三色膠原染色、透射電鏡及掃描電鏡進行 圖2 HE染色(x400)光鏡觀察兩斷面均未址藍色胞核或者紅色胞質等細 胞結構(a脊髓橫斷面b脊髓縱斷面)圖3麗春紅2R一亮綠SF染色 ()<400)光鏡觀察:淡綠色缸示為脊髓灰質背景,未見應該被染成橙紅色的 神經纖維柬軸索和髓鞘(a脊髓橫斷面b脊髓縱斷面)圖4應用 Malloryi色膠原染色(×400)顯示細胞外基質即膠原纖維被染成藍色,頸、 胸、腰i段脊髓橫斷面膠原纖維均未被破壞.形態保存.被染成藍色.均呈 網孔狀結構(a頸段脊髓橫斷面b胸段脊髓橫斷面c腰段脊髓橫斷 面)圖5 Mallory=三色膠原染色(×400)硅爪頸,胸、腰■段脊髓縱斷【白i被 染成藍色。形態均呈平行管狀結構(a頸段脊髓縱斷面b胸段脊髓縱斷 面c腰段脊髓縱斷面) 萬方數據 換頁 758 中國脊柱脊髓雜志2010年第20卷第9期 Chinese如arnd礦卻ineand卻iradCord,2010.y“.20.No.9 圖6超薄切片透射電鏡檢查顯示頸、胸、腰i段脊髓橫斷面均早網孔狀結構,未見細胞結構(a頸段橫斷面b胸段橫斷 面c腰段橫斷面)(x700)圖7掃描電鏡顯爪頸、胸、腰三段脊髓縱斷面形態均呈平行管狀結構,未見細胞結構(a頸 段縱斷面b胸段縱斷面c腰段縱斷面)(x1000) 表I脫細胞脊髓頸、胸、腰段橫斷面網孔與縱斷面平 行管狀結構參數 (;虹。斗m,n=5) 往:①與頸段比較2<0.05。②‘j胸段比較P=-O.05 比較,結果證實三段脊髓橫斷面均呈網孔狀結構. 縱斷面均呈平行管狀結構。同時統計學處理結果 顯示頸、腰段脊髓孑L徑與胸段脊髓孔徑有差別. 頸、腰段脊髓孑L徑較大.而胸段脊髓孔徑最小。在 解剖上,正常脊髓有兩個膨大。即頸膨大和腰骶膨 大.呈現兩端粗中間細的大體形態.這可能是脊髓 孔徑頸、腰段較大而胸段較小的一個解剖學原因。 綜上所述,頸、胸、腰i段脊髓均可用于SCI修復, 但在脊髓組織T程中,材料孔徑的大小是否對種 子細胞的局部增殖、神經元及軸突的再生產生影 響有待于進一步探討。 4參考文獻 1.SaehlosE.ReisN,AinsleyC,eta1.Novelcollagenscaffolds withpredefinedinternalmorphology.madebysolidfreeform fabrication[J].Biomaterials.2003.24(8):1487-1497. 2.HenchLL,PolakJM.Third-generationbiomedicalmaterials[J]. Science。2002,295(5557):1014—1017. 3.郭樹章.任先軍,蔣濤,等.脫細胞脊髓天然支架的制備及形態 學觀察【JJ.中國矯形外科雜志,2007,15(3):225—228. 4.ChengH.HuangYC。ChangPT。eta1.Laminin-incorporated nervecomluitsmadebyplasmatreatmentforrepairingspinal cordinjury【J】.BiochemBiophysResCommun。2007,357(4): 938—944. 5.O’ConnorSM,StengerDA,ShafferKM,eta1.Primaryneural precursorcellexpansion,differentiationandeytosolicCa“re— sponse inthree—dimensionalcollagengel【J1.jNeuroseiMet hods,2000,102(2):187—195. 6.MaW,FitzgeraldW.O’ShaushnessyTJ,eta1.CNSstemand progenitorcelldifferentiationintofunctional.neuronalcircuits inlherP—djmPnsjonalcollagengels【J】.JExpNeurol,2004,190 (2):276—288. 7.MurakamiT,FujimotoY,YasunagaY,eta1.Transplantedneu— renalprogenitorcellsinaperipheralHelve gappromote nerve repair[J].BrainRes.2003.974(1-2):17—24. 8.郭樹章,任先軍,蔣濤,等.脫細胞脊髓支架的成分分析【J】.第二 軍醫大學學報.2007.29(13):1313一1315. 9.郭樹章。任先軍.蔣濤。等大鼠脫細胞異體脊髓支架的免疫原 性研究【J】.巾圍矯形外科雜志.2007.15(6):444-446. 10.尹文化.金大地,鄧許勇,等.機械振蕩對脊髓去細胞支架形 態學的影響IJI.南方仄科大學學報,2008,28(10):1748一1751. (收稿U期:2010—05—24修回n期:2010-07一OI) (英文編審 蔣 欣,郭萬首) (本文編輯李偉霞) 萬方數據 換頁

    上一篇:口腔臨床教學方法探討   下一篇:沒有了
    :::: 支付方式 ::::
    :::: 服務熱線 ::::
    (周一至周五8:30-17:30)
    (周六至周日9:00-18:00)
    服務電話:020-61131011
    020-61131022 轉82
    傳真:020-61131022
    電子郵件:[email protected]
    [email protected]
    服務QQ:130009919
    130008818
    :::: 熱點文章 ::::
    :::: 相關文章 ::::

    · MBA
    · MPA
     · 教育碩士
    · 法律碩士
    · 工程碩士

    服務電話:020-61131011;020-61131022 轉82 投訴電話:020-61131011;020-61131022 轉88 傳真:020-61131022
    電子郵件:[email protected] [email protected] 服務QQ:130008818 130009919 (工作時間:周一至周五8:30-20:30 周六至周日9:00-18:00)
    © 2002-2004 輕松論文網  網絡實名:輕松論文
    SiteMap
    8888彩票 www.4521s.com | www.7225o.com | JS1388e.com | www.456338.com | WWW.769036.COM | www.21202f.com | www.47506i.com | jimei6666.com | 3405o.com | tt6825.com | 92569.com | www.808761.com | WWW.878155.COM | www.615006.com | www.5189111.com | www.9928b.com | uu7742.com | 20053355.com | 6688xpj.com | www.823444.com | www.166127.com | WWW.617099.COM | WWW.789581.COM | www.15355x.com | www.55238h.com | www.4996sh.com | 109899.com | 7599l.com | 0485y.com | angei9gov.cn | www.868004.com | www.590981.com | WWW.772567.COM | WWW.101427.COM | www.9356c.com | www.7225m.com | www.138578.com | c51iggd.com | 00774kk.com | 452.com | 1489w.com | 6137c.com | www.96386u.com | www.855312.com | WWW.511383.COM | WWW.374318.COM | WWW.699564.COM | www.371r.cc | www.86267y.com | www.siji05.com | www.4058i.com | www.998855l.com | 3258z.com | 9411ttt.com | 90856i.com | 062eee.com | 88894f.com | 8881240.com | djbet338.com | 01234mmm.com | 1669a.com | 2hga.com | hga8585.com | s2894.com | www.84966.com | www.tm003.com | www.wcp666888.com | www.43131b.com | www.011225.com | www.496918.com | www.642977.com | www.994948.com | WWW.413691.COM | WWW.919855.COM | WWW.61058.COM | WWW.652323.COM | WWW.499468.COM | WWW.900007.COM | WWW.200887.COM | WWW.75705.COM | WWW.260195.COM | WWW.788420.COM | WWW.594775.COM | WWW.180700.COM | www.998349.com | WWW.634655.COM | WWW.303325.COM | WWW.11970.COM | WWW.408366.COM | WWW.654265.COM | WWW.519790.COM | WWW.773543.COM | WWW.506691.COM | WWW.845234.COM | www.452812.com | www.23277.com | www.c9.com | www.123127.com | 91019n.com | 2477000.com | 8742t.com | 3679dd.com | pj88kk.com | 1788hg.com | 8030c.com | 2589.com | www.33115rr.com | www.xpj228888.com | www.8998883.com | www.hg9377.com | www.371z.cc | WWW.527455.COM | WWW.591389.COM | WWW.715113.COM | www.269707.com | 94557d.com | 1775y.com | 3678h.com | 28288aa.com | 8827vv.com | www.428858.com | www.5981d.com | www.js7000.com | www.4988h.cc | www.qbwc6.com | WWW.323947.COM | WWW.786023.COM | www.800471.com | 88233.com | 9949y.com | 6363ii.com | www.063259.com | www.55676h.com | www.6364w.com | WWW.190563.COM | WWW.459077.COM | www.202427.com | 7989v.com | jx2300.com | 0600o.cc | www.b35ii.com | www.6889775.com | www.15355g.com | WWW.564163.COM | WWW.594855.COM | www.239544.com | 2190s.com | d40033.com | d55.com | www.r94600.com | www.16878q.com | WWW.286210.COM | www.890402.com | 2595e.com | wx99.com | 3mgmttt.com | www.xj7003.com | www.376500hd.com | WWW.696777.COM | WWW.30666.COM | www.456786.com | 0554xc.com | 9339999d.com | www.bet63j.com | www.50052f.com | WWW.25798.COM | WWW.386830.COM | www.111541.com | 5988365.com | 8682325.com | www.5250666.com | www.939781.com | WWW.538112.COM | www.811927.com | 876878v.com | 63965555.com | www.h80288.com | www.jcai5.com | WWW.789154.COM | cp885.cc | 7599.at | 58802x.com | www.22274.vip | WWW.330030.COM | www.640477.com | zgfcw.cc | feicai0512.com | www.78680v.com | www.006ac.com | WWW.681078.COM | www.196807.com | 22222007.com | 2709b.com | www.558105.com | WWW.764866.COM | www.308908.com | 441343.com | 9030h.com | www.9646u.com | WWW.217778.COM | 8080.cc | ss4255.com | www.55060e.com | www.ascp1.com | WWW.646519.COM | 99555002.com | 3379c.com | www.4923p.com | WWW.749779.COM | 494049.com | 97297p.com | www.9464001.com | WWW.156522.COM | www.534658.com | 4995o.com | www.xx3.com | www.5854d.cc | www.655096.com | 9101908.com | www.7777yh.com | www.5cpb.com | www.911710.com | 5676559.com | 26668k.com | www.4809a.com | WWW.640073.COM | 49l.cc | 3416e.com | www.479dh.com | WWW.447372.COM | www.362477.com | hc.cc | www.6661ylg.com | www.gyfc1.com | www.524947.com | 779644.com | www.6900666.com | WWW.662130.COM | www.83939.com | qmbc9.com | www.77801k.com | WWW.899479.COM | j2976.com | www.4212e.com | WWW.501379.COM | www.0063.cc | 668cp77.com | www.33588w.com | WWW.58575.COM | 78119955.com | www.66655.com | WWW.423377.COM | 0778.com | www.500558.com | WWW.600554.COM | 212300.com | www.ggt.99233t.com | www.hx1183.com | www.66376v.com | 1036898.com | www.5091y.com | www.155782.com | t2490.com | www.50732w.com | www.524880.com | 09780.com | www.66907.cc | www.348377.com | 6320666.com | www.4323s.com | www.657666.com | 01885i.com | www.22303.cc | 1128kj.com | 5647oo.com | WWW.549630.COM | 88559193.com | www.138cpv.com | WWW.873055.COM | 1624cc.com | www.458633.com | WWW.318129.COM | 6002n.com | www.61268888.com | www.188721.com | 923720.com | WWW.730565.COM | amxsyl0.com | 56987dd.com | WWW.125577.COM | bwinmmm.com | www.559990.com | www.638713.com | WWW.233896.COM | 04666o.com | WWW.518909.COM | 66119vip.com | www.p32031.com | WWW.658964.COM | 02.bet | www.33997p.com | www.hj94.com | www.88166h.com | WWW.64267.COM | h9539.com | www.66653g.com | www.788807.com | www.8967m.com | WWW.199250.COM | yth67.com | www.6888779.com | www.202406.com | 56988vv.com | WWW.707341.COM | 6269qq.com | www.35231.com | 983888s.com | www.mm55826.com | WWW.223395.COM | 496rr.com | WWW.318935.COM | am51335.net | www.89777d.com | 504508.com | www.71071a.com | WWW.93518.COM | 7599w.com | www.50788f.com | 32126q.net | www.32031b.com | www.577032.com | 4833044.com | WWW.51028.COM | 55967u.com | WWW.566012.COM | 8159hhh.cc | www.54968h.com | 822330.com | www.624618.com | www.599049.com | www.jxcp3333.com | WWW.820809.COM | 3122jj.com | WWW.883739.COM | 4488o.com | WWW.709049.COM | 30175555.com | www.ct8877.com | hv712.com | www.5856872.com | 4195kk.com | www.xpj6886.com | www.178756.com | www.xpj2008.co | www.705059.com | gg3189.com | WWW.45877.COM | 55331l.com | WWW.764675.COM | x4255.com | WWW.195853.COM | 7616.net | WWW.442455.COM | b4255.com | WWW.789677.COM | 566777o.com | WWW.882747.COM | 3846bbb.com | WWW.618455.COM | 3640w.com | WWW.667483.COM | 3550.com | WWW.614708.COM | 2349012.com | WWW.148577.COM | 112u.net | WWW.489155.COM | 0080l.com | WWW.61867.COM | fc9559.com | WWW.348102.COM | xbqjn.com | www.976561.com | www.dcw566.com | www.924177.com | www.baifu35.com | www.596112.com | www.3066bb.com | www.kj8444.com | www.amjs3456.com | bdg213.com | www.66376m.com | 33p88.cc | WWW.188578.COM | 53262ee.com | WWW.923192.COM | 998b.cc | WWW.899782.COM | www.97cp456.com | www.426667.com | www.ag3388.com | 5001q.com | www.88266w.com | 2127z.com | www.66ffp.com | 87965cc.com | WWW.694421.COM | 3089m.com | www.786587.com | www.8850w1.com | 3818899.com | www.113744.com | 1429e.com | WWW.787367.COM | mm2649.com | www.768399.com | www.79095g.com | 11683344.com | www.29277f.com | 1294y.cc | WWW.786718.COM | www.l32939.com | www.702156.com | www.33588n.com | p888ab.com | WWW.316669.COM | www.c44aa.com | www.501340.com | www.4245.com | 13868686.com | WWW.582557.COM | 4323t.com | www.711853.com | www.11475.com | 55966.com | WWW.90398.COM | xpj668.com | www.wcp666888.com | www.yh7771.com | 0008.io | WWW.654116.COM | www.9737oo.me | 168c6.com | WWW.481236.COM | 3009w.com | www.370833.com | www.8722.com | 300089v.com | WWW.732055.COM | www.99113l.com | 7196t.com | www.9205f.com | 29918.com | www.737689.com | www.hg77750.com | 3644o.com | WWW.301921.COM | www.4521r.com | 4260044.com | WWW.301788.COM | www.xpj5959.com | dfs12345.com | WWW.60599.COM | www.8967e.com | 38345c.com | WWW.94966.COM | www.799666r.com | 22dd8332.com | WWW.514655.COM | www.cai51.vip | 5360ee.com | www.am2255.com | dd.cc | www.1p6.com | WWW.318872.COM | 272q.net | 55545b.com | WWW.898663.COM | www.80969a.com | 1649.com | WWW.529672.COM | www.4521n.com | mg437788.com | WWW.610802.COM | www.hd8674.com | 6723888.com | www.401268.com | www.9478s.com | 8036c.com | 974848.com | WWW.352066.COM | www.5099uu.com | szgj666.com | WWW.588076.COM | www.556537.com | 8569811a.com | www.700590.com | www.33588g.com | 6830z.com | 69448822.com | WWW.5077.COM | www.c80288.com | ny204.com | www.689244.com | www.15355t.com | 6220vv.com | 97297x.com | WWW.885014.COM | www.88xpj68.com | 111ctx.com | www.28874.com | WWW.746733.COM | www.6880cc.com | 114644.com | www.584911.com | www.5xct.com | www.120529.com | 500000631.com | WWW.851543.COM | www.58677.cc | 4052u.com | 50067o.com | WWW.296209.COM | www.77802y.com | bc2023.com | 08820055com | WWW.542365.COM | www.6364u.com | www.cfcp777.com | 88850aa.com | www.795917.com | www.yi660.com | www.58118e.com | 26119f.com | www.218292.com | WWW.561995.COM | www.jsdc9111.com | 38848.com | www.tk345.com | WWW.774767.COM | www.9646k.com | 3178gg.com | 1259c.com | www.577062.com | WWW.55320.COM | www.jsdc9333.com | 386kzi.com | 6033p.com | www.891079.com | WWW.648968.COM | www.q063801.com | 9506j.com | 31435544.com | WWW.669929.COM | www.fcyl2.com | www.00778v.com | 459845.com | 6641z.com | WWW.863118.COM | www.al5678.com | www.601710.com | ww38648.com | 2222k13.com | www.589879.com | WWW.521187.COM | www.8998733.com | 44335003.com | 新2.com | 56987qq.com | WWW.888386.COM | WWW.495655.COM | www.742988.com | jsjlb11.com | d58955.com | 88627.com | WWW.686633.COM | WWW.27466.COM | www.14168d.com | oo2649.com | 11005x.com | www.xinyc8.com | WWW.517392.COM | www.055cp.cc | www.830217.com | 0747pp.com | 463a8.com | 8988444.com | www.909935.com | WWW.357432.COM | www.bet73e.com | www.8850w9.com | 2146i.com | 67877g.com | www.432123.com | WWW.790004.COM | WWW.798102.COM | www.yyy10000.com | www.jjjj009.com | 77606s.com | 4812q.com | www.040451.com | WWW.111457.COM | WWW.103584.COM | www.99788r.com | www.6880jj.com | 2677ccc.com | 3066aaa.com | 3467x.am | 7776838.com | WWW.412011.COM | WWW.139176.COM | www.0014s.com | www.e94600.com | www.98698k.com | 8449ss.com | 0615009.com | 66300vip19.com | www.3524a.com | www.936570.com | WWW.145012.COM | www.cp8006.cc | www.379801.com | www.w80288.com | 4630077.com | 50067x.com | 77ee940.com | 201877886.com | 990990.com | www.621431.com | WWW.67816.COM | WWW.388969.COM | www.055s.cc | www.16065i.com | www.79095i.com | www.yin3939.com | bdg1100.com | 4018l.com | 69990f.com | kn8pe8fq.pp.163.com | www.333488.com | www.622507.com | WWW.778998.COM | WWW.378444.COM | WWW.317336.COM | www.2408d.com | www.vns18158.com | www.js68111.com | www.mhcp.com | feicai0898.com | 2059.com | 555445.com | 78666b.com | uu1331.com | sb5508.com | 4116m.com | 16668.cc168kj.com | www.498166.com | www.911888.com | WWW.122174.COM | WWW.891094.COM | WWW.775002.COM | WWW.791477.COM | WWW.390084.COM | www.77dwj.com | www.66653q.com | www.d17848.com | www.7240o.com | www.109007.com | www.ag0456.com | www.6664ylg.com | www.baifu35.com | www.lfcp123.com | 58339.com | 588vvv.cc | 22556j.com | 00jj8331.com | 11ll8332.com | 40661115.com | 521102.com | 88993n.com | 01234bb.com | 35222tt.com | 3679pp.com | ii4255.com | 3678m.com | 4379y.com | 463s8.com | 0343f.com | 66665.biz | 4556xl.com | 77606m.com | 9068i.com | 3890b.com | 34u35.com | 28288ee.com | 55331ff.com | bwin8n.com | 50067s.com | yy2205.com | 44qq8331.com | 56988.com | 6363ss.com | rr4675.com | www.307922.com | www.xc829.com | www.987072.com | www.e92776.com | www.xpj2050.com | www.06820r.com | www.w84.com | www.56011p.com | www.68993266.com | www.sx13997.com | www.60108n.com | www.7782w.com | www.bei08.com | WWW.185654.COM | WWW.729714.COM | WWW.705609.COM | WWW.114837.COM | WWW.335481.COM | WWW.266160.COM | www.725106.com | www.249711.com | www.87609b.com | 630.cc | xpj9411.cn | 708365.com | 23456.cc | 61329977.com | 00064066.com | www.hg173i.com | www.f063801.com | www.1117758.com | www.81520f.com | www.99jte.com | WWW.312696.COM | WWW.898947.COM | WWW.351545.COM | www.802865.com | www.89894i.com | 386kzo.com | 78666u.com | 1992789.com | 11bb8332.com | 091061.com | www.hg8xx.com | www.9187n.com | www.65707w.com | WWW.49459.COM | WWW.61262.COM | WWW.893899.COM | www.544096.com | www.64839.com | 3121tt.com | 0193377.com | 33ss8332.com | www.66c668.com | www.3032gg.com | www.511204.com | WWW.679285.COM | WWW.496030.COM | WWW.114579.COM | www.79800a.com | 55818r.com | 3678h.com | 37570h.com | www.04567x.com | www.0194001.com | www.hc8858.com | WWW.837989.COM | www.810609.com | www.118822.com | 3473o.com | xx3336.com | 6146t.com | www.w84b.com | www.35918s.com | WWW.619402.COM | WWW.200483.COM | www.00166.com | 55818.com | 34s35.com | 953644.com | www.hx99365.com | www.5441z.com | WWW.566254.COM | www.936570.com | 888.tf | bwinkkk.com | 2383qq.com | www.503013.com | www.rrqp777.com | www.tlcp2.com | WWW.677370.COM | www.338785.com | 69990n.com | 35222s.com | www.2y926.com | www.72002.com | WWW.680801.COM | WWW.377758.COM | 8988kj.com | xpj677m.com | 8901s.com | www.30350n.com | www.2373v.com | WWW.702009.COM | www.155782.com | yyh914.com | js777dl.com | www.o063801.com | www.267by.com | WWW.785875.COM | www.60123e.com | 8520h.com | 2381tt.com | www.792083.com | WWW.8708.COM | www.924177.com | 44betbet365.com | 4340q.com | www.b35mm.com | www.073wy.com | WWW.534654.COM | www.118gpkj.com | 3454549.com | www.747855.com | www.61655t.com | WWW.238268.COM | www.888317.com | 0612g.com | www.c555jj.com | www.60123p.com | WWW.369398.COM | 3888kj.com | 9659o.com | www.19019i.com | www.13633.cc | WWW.226863.COM | 55818j.com | ddcp88.com | www.40288i.com | WWW.61636.COM | www.775702.com | 6002f.com | 0747n.com | www.bet365gf.co | WWW.661616.COM | 48554.com | 4747.com | www.255030.com | www.6364e.com | WWW.73763.COM | 3245y.com | mgm3242.net | www.ihg5566.com | WWW.177999.COM | liuhe.la | emb8578.com | www.834546.com | WWW.130448.COM | www.188926.com | 21117a.com | www.04567t.com | WWW.108508.COM | www.550973.com | aobo19.com | www.682260.com | www.dan03.com | www.745855.com | b918.com | www.9737gg.com | WWW.27528.COM | www.314677.com | 0245j.com | www.80188h.com | WWW.550184.COM | www.136503.com | 3967z.com | www.44118s.com | WWW.72868.COM | 64224.com | 06389797.com | www.16065u.com | WWW.513925.COM | 22hh8331.com | ca3055.com | www.3552q.com | www.781217.com | aaa2267.com | www.7225v.com | WWW.322424.COM | 11422n.com | y2554.com | www.61655s.com | www.917737.com | 1331ee.com | www.06820i.com | WWW.653593.COM | kj8314.com | 9149q.com | www.12455h.com | www.755213.com | 888559.com | www.32031a.com | WWW.450213.COM | BY30836.com | www.79500w.com | WWW.517004.COM | www.52072i.com | b2146.com | www.909938.com | www.927576.com | 37688u.com | www.86339y.com | WWW.292559.COM | 2842266.com | www.bwinyz43.com | WWW.169133.COM | 20775511.com | www.938n.cc | WWW.332794.COM | wns.com | feicai0952.com | www.qmfc2.com | www.52072b.com | 33ii8331.com | www.3479u.com | www.188393.com | 55331g.com | www.8499o.com | www.206881.com | sp2088.com | www.6769l.com | www.190881.com | long88.com | www.3126g.com | www.hcw332.com | fll8.com | www.flcb2.com | www.666614.com | bm1395.cc | WWW.784234.COM | 4992535.com | www.310040.com | WWW.717610.COM | feicai0516.com | www.b80288.com | WWW.746563.COM | 9895v.com | www.hd8672.com | www.610181.com | bwin8d.com | www.2632a.com | www.48566.com | 06006e.com | WWW.1695.COM | wnsr8819.com | www.h063801.com | WWW.77175.COM | 924022.com | www.60108b.com | www.97655u.com | 20188u.com | WWW.867744.COM | 22284066.com | www.3w444.com | WWW.650234.COM | 994167.com | www.7782j.com | www.443566.com | www.158cai.com | WWW.301488.COM | 7599pp.com | www.yl1981.com | www.302210.com | 2019l.cc | WWW.126607.COM | 138.am | www.js00099.com | www.356411.com | 37570y.com | WWW.628163.COM | 0208bb.com | www.55717n.com | www.397836.com | 88807l.com | WWW.905181.COM | 3258t.com | www.582010.com | www.66830.com | www.551c93.com | WWW.286262.COM | 40420022.com | www.igcp5.com | 9988vn77.com | www.pjc66.vip | www.679975.com | 2543jc.com | WWW.662307.COM | ab99988.com | www.81520b.com | 56878.com | www.huangma22.com | WWW.133230.COM | 7942.com | WWW.228967.COM | 4195q.com | www.51515h.com | 55545a.com | www.369401.com | www.598799.com | 8742xx.com | WWW.358081.COM | 86611h.com | WWW.358780.COM | 32126i.net | www.709wb.com | www.78222.com | www.4058cc.com | www.690802.com | 081965.com | WWW.212803.COM | 87680h.com | WWW.644392.COM | xpj8.com | www.czg1.com | 3mgmrrr.com | www.7239c.com | 18775m.com | www.2566y1.com | www.177534.com | www.6776kk.com | www.859505.com | 5446q.com | WWW.200258.COM | ued.bet | WWW.452225.COM | 9679n.com | WWW.140030.COM | z1458.com | WWW.607966.COM | 3404o.cc | www.ybao1.com | 111122ff.com | www.33588m.com | zz1331.com | www.49956t.com | 9068t.com | www.83033d.com | lj552.com | www.90wb.top | mgm3242y.com | www.2418m.com | 66775004.com | www.720650.com | xpj915.com | www.sx1844.com | 33vn77.com | www.80065f.com | 33ydgj.com | www.38381.cc | 2709h.com | www.ya939.com | bwin2808.com | WWW.298738.COM | 4473.com | WWW.310525.COM | 3242g.com | WWW.2546.COM | 78365.com | WWW.137144.COM | 70118b.com | WWW.818831.COM | 9030b.com | WWW.260216.COM | www.caipiao88c.com | www.403189.com | www.2544g5.com |