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    地黃多糖的提取純化及其對糖尿病小鼠血糖的影響研究
    關鍵字:影響,研究,糖尿病,提取,及其,EF,IJ,CD,AB,wx 發布時間:2011-08-20

    StraitPharmaceuticalJournalVol22No.92010 【5】陳穎珠.動脈粥樣硬化和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[U】.北京: 人民衛生出版社。2007.271. 【6】李慧英.大蒜油的傳統開發【J】.中成藥.1993.t5(6):14. 【7】GebhardtR.Multipleinhibitoryeffectsofgarlicestraetsoneholesterol biosynthesisinhepatocytesU}.Lipids.1993。培(7】:613—619. 【8】AdogaGI,OsujiIEffectofgarficoilertractonBeruln,fiver蚴kidney eBgymesof ratsfedonhighSUCrOSeandalcoholdietsO].Biochemistry International.1986,13(4):615—624. 【9】何曉洋.優質大蒜出口潛力大【J】.農村實用技術與信息.2002 (8):16. 【lO)張驪,向智敏.超臨界C()2用于蒜酶失活和大蒜SOD的保留【J】 .食品科學。1997(4):27—29. (11】余伯良。吳士業.不同脫臭方法對大蒜抗菌效力的影響【J】.中 國調味品.1998(8):8—11. [12】曾凡俊.張月天.陳松波.大蒜油軟膠囊保健食品的研究[J].食 品與發酵工業.2002(12):24—27. 【13】李娜.大蒜的功效成分及其應用的研究進展CJ}.中國食物與營 養,2007(11):25—27. 地黃多糖的提取純化及其對糖尿病小鼠血糖的影響研究 趙平鴿1,劉曉2(1.浙江省義烏中心醫院義烏322000;2.徐州醫學院藥學院徐州221004) 摘要:目的研究從地黃中分離純化多糖的方法,并探討地黃多糖對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠的降血糖作用。方法地黃粉束石油醚、乙 醚除去脂溶性雜質.80%的乙醇脫單糖、低聚糖.熱水浸提液經濃縮,醇析,Savagc法除蛋白。離子水逆流透析.H2()2脫色得地黃粗多糖。苯酚.濃 硫酸比色法測多糖含量。將腹腔注射四氧嘧啶建立的糖尿病小鼠動物模型動物隨機分為模型組、地黃多糖治療組(RGP治療組)、阿卡波糖治療 組(AR治療組).另設立正常對照組。每組給藥后4周末測定空腹12h血糖(GLu)、甘油三酯(TG)、極低密度脂蛋白.膽固醇(VLDL.C)、總膽固 醇(TC)的含量及小鼠體重.對各組的血糖和血脂水平進行比較分析。結果①490nm為樣品的吸收波長。線形回歸方程為:Y=0.0056X+ 0.4361.相關系數R2=0.9995;地黃粗多糖的提取率為45.5%,總糖含量為35.2%。⑦與正常組相比。模型組體重降低、血糖升高,相比較有顯 著性差異(P<0.05);AR治療組、RGP治療組與模型組相比.體重增加、血糖降低,相比較有顯著性差異(P<0.05)。③模型組血清血脂水平顯 著高于正常組(P<0.05);AR治療組、RGP治療組與模型組比較.TG、VLDL.C降低,相比較有顯著性差異(P<0.05);治療組與模型組比較TC 水平變化不大。差異無統計學意義(P>o.05)。結論該方法簡便可行.可以作為地黃多糖提取分離純化的有效方法;地黃多糖具有能緩解糖 尿病小鼠體重降低,降低糖尿病小鼠血糖水平,調節血脂紊亂的作用。 關鍵詞:地黃多糖;提取純化;糖尿病;血糖;,1,鼠 中圉分類號:R965文獻標識碼:A文章編號:1006.3765(2010).09.0029.04 ExtractionandpurifctionofrehmanniaglutinosapOIySaCCharideanditsel- fectonbloodglucoseindiabeticmice ZHAOPing-ge,LlUXiao(1.ZhejiangprovinceYiwuCentralHospital,Yiwu322000,China;2.CollegeofPharma- cy,XuzhouMedicalCollegeXuzhou221004,China) ABSTRACT:OBJECTIVETostudytheextractionandpurifctionofrehmanniaglutinosapolysaceharide(RGP) anditseffectonbloodglucoseindiabeticmiceinducedbythealloxan.METHODSTherehmanniaglutinosa powderwasremovedthefat一,solubleimpuritiesbyPetroleumetherandethylether,themonosaccharidesand oligosaecharideswaspeeledoffusing80%ethan01.Therehmanniaglutinosapolysaecharidewasextractedandpu— rifledthroughhotwaterextractedandconcentrated,precipitatedwithethanol,peeledoffproteinwithSavage method,deionizedwatercountercurrentdialysis,removedthepigmentin‘H202.TheRGPcontentwasdetected withPhenol—concentratedsulfuricacidcolorimetry.AlloxanWasadministeredintraperitoneallytoestablishdiabetic modelsinmice,afterthesuccessofmodeling,experimentalanimalsweredividedintothemodelgroup,theRGP treatmentgroup,ARtreatmentgroupandsetupanormalcontrolgroup.4weeksaftertreatment,the12hfasting bloodglucose(Gl。U),triglyceride(TG),verylowdensitylipoproteincholesterol(VLDL-C),totalcholesterol(TC) levelsandbodyweightofmiceweredetected,theeach group’Sbloodglucoseandlipidlevelswere ana一 ?29? 萬方數據 換頁 海峽藥學2010年第22卷第9期 lyzed.RESULTS①Thesamples’UVabsorptionwas490nm,linearregressionequation:Y=0.0056X+ 0.4361,correlationcoefficientR2=0.9995;theextractionrateofRGPwas45.5%,totalsugar contentwas 35.2%.②Comparedwithnormalgroup,theweightlossandelevatedbloodglucoseinthemodelgroup,thediffer— encewassignificant(P<0.05);comparedwithmodelgroup,thegainweightanddecreasedbloodglucoseinthe ARtreatmentgroupandRGPtreatmentgroup.thedifferencewassignificant(P<0.05).③Theserumlipidlevels ofthemodelgroupweresignificantlyhigherthanthatofthenormalgroup(P<0.05);Comparedwiththemod— elgroup。theTGandVI,DI。。ClevelsoftheARtreatmentgroupandRGPtreatmentgroupdecreased,thediffer— encewassignificant(P<0.05);comparedwithmodelgroup,theTClevelsoftreatmentgroupwas nosignificant— lYdifference(P>0.05).CONCLUSl0N Thismethodissimpleandfeasible,canbeusedasaeffectivemethcIds ofRGPextractionandpurification:RGPcanalleviatetheweightlOSSofdiabeticmice,reducebloodglucoseIevels indiabeticmiceandregulatedbloodlipiddisorder. KEYWORDS:Rehmanniaglutinosapolysaccharide;Extractionandpurification;Diabetes;Bloodsugar;Mice 地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.) 的干燥根莖。為常用中藥。現在藥理已表明地黃在造血系統。 內分泌系統、免疫、抗腫瘤及心血管系統等有著廣泛的生物活 性【lJ。許多植物多糖具有免疫促進作用,抗腫瘤作用。抗衰老 活性.降血糖活性,抗病毒活性,以及降血脂活性等。而且多 糖因其特殊的生物活性和無毒副作用而被廣泛用于臨床用 藥、疫苗和保健食品。多糖作為提高機體免疫功能的保健品 已被廣泛開發,但許多多糖產品僅僅停留在保健品階段。未能 開發成藥物,主要原因是多糖的分離純化困難,技術不過關。 目前對地黃多糖的提取及分離純化的研究少見報道,特別是 對地黃多糖的提取工藝的研究尚未見報道。 糖尿病(DM)是一組因遺傳和環境因素相互作用引起的 臨床綜合癥。因胰島索分泌絕對或相對不足和靶細胞對胰島 素敏感性降低,引起的糖、蛋白質、脂肪和繼發性的水、電解質 代謝紊亂及酸堿平衡失調的內分泌代謝疾病.以高血糖為其 共同主要標志,近年來發病率呈逐漸增高的趨勢C2)。目前對 糖尿病仍缺乏有效的治療方法,臨床采用的降糖藥或存有毒 副作用,或價格昂貴,而且西藥由于化學成分單一。作用機制 只是針對降低血糖的某一環節,長期應用造成靶器官鈍化而 使其出現用藥一段時間后療效下降、不持久現象。近年來.國 內外對具有降糖作用的植物多糖的化學和藥理研究進展迅 速,多糖類成分不僅是一種非特異性免疫增強劑,而且具有降 血糖、抗病毒、抗凝血等作用【3】。從天然植物中尋找安全有 效、廉價的降糖藥物。己成為近年來人們關注的焦點。地黃中 含有豐富的多糖類物質,地黃多糖是地黃中的有效成分之一. E1益受到人們的關注,其研究也逐漸增多。但從地黃中提取 多糖成分進行降血糖作用研究,國內外尚未見報道,這對于地 黃的進一步開發利用具有重大意義,也有利于推動糖生物學 的深入研究。 為此,本文對地黃多糖的提取與純化的方法進行研究,并 對地黃多糖對糖尿病小鼠降糖作用進行探討。以期為地黃的 開發及其綜合利用提供理論參考。 1儀器與材料 1.1材料試驗藥材:將采自河南懷慶的新鮮地黃藥材浸入 ?30? 黃酒,酒液沒過藥面.用小火蒸千藥液后,取出曬干制得。將 地黃在80℃烘箱中干燥至恒重,粉碎過20目篩。置干燥中備 用。試驗動物:健康ICR小鼠,雌雄各半,體重在259309, 由徐州醫學院動物實驗中心提供。小鼠分籠飼養,置安靜、避 強光、潔凈、室溫20℃-25℃、相對濕度60%-65%的環境中 喂普通鼠飼料,自由飲水,進食。通風良好。 1.2試劑阿卡波糖(:ltl京拜耳醫藥保健有限公司產品.國 藥準字。19990205。臨用前用0.2%的羧甲基纖維素鈉配成含 阿卡波糖lmg?mL-1的混懸液);四氧嘧啶(美國sigma化學 公司產品。臨用前用0.9%生理鹽水配成1%四氧嘧啶溶液); 血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和極低密度脂蛋白膽固 醇(VLDL—c)、血糖(GLu)測定試劑盒均由四川省邁克科技有 限責任公司提供。乙醇、苯酚、石油醚、丙酮、正丁醇、濃硫酸、 氯化鈉、乙醚、氫氧化鈉等均為市售分析純。 1.3儀器Uv.probe紫外分光光度計(日本島津);Shi. maduFTIR8300紅外光譜儀(日本島津);BSZ.自動部分收集 器(上海滬西分析儀器廠);電熱恒溫干燥箱(江蘇金壇億通電 子有限公司);層析柱(1.6X20cm)(上海錦華實驗儀器廠); 旋轉蒸發儀(日本東京理化EYELA);PB203一N電子分析天平 (瑞士梅特勒.托利多儀器有限公司);722S分光光度計(上海 精密科學儀器有限公司);TMS-10241024i全自動生化分析儀 (日本東京醫療)。 2方法 2.1地黃多糖的提取分離 2.1.1地黃粗多糖的提取:取一定量的地黃依次用石油醚、 乙醚除去脂溶性雜質,然后用80%的乙醇脫單糖、低聚糖。 加10倍量的水90~100℃提取3次。3h/次,合并水提液,過 濾。70℃水浴減壓濃縮至適量,加入5倍量95%的乙醇純 析.靜置過夜。離心過濾,置真空冷凍干燥得地黃多糖粗品。 2.1.2地黃粗多糖的純化:將地黃粗多糖溶于蒸餾水,去不 溶物。按Sevag法(氯仿:正丁醇=4:1)脫蛋白.重復10次以 上。然后移至透析袋中用去離子水逆流透析24h。直至紫外光 譜分析檢測無蛋白吸收。以氨水調節pH為8,滴加H202 50℃保溫脫色2h,減壓濃縮,加入5倍量的無水乙醇,靜置過 萬方數據 換頁 StraitPharmaceuticalJournalVol22No.92010 夜,離心收集沉淀。將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2 次,冷凍干燥得去蛋白地黃粗多糖純品。 2.1.3紫外光譜分析:取地黃粗多糖純品適量,加水溶解。配 制成濃度為1.0g?L-1的多糖水溶液,采用紫外可見分光光 度法190—700nm范圍內掃描。 2.1.4對照品溶液的制備:精密稱取干燥至恒重的無水葡萄 糖對照品,用蒸餾水溶解后定容,配成濃度為116pg?mL1的 對照品溶液。 2.1.5供試品溶液的制備:精密稱取上述提取得到的去蛋白 地黃粗多糖純品0.5g。用蒸餾水溶解,稀釋至刻度,制成濃度 為lOOgg?mL-1的供試品溶液。 2.1.6標準曲線的制備:根據苯酚一濃硫酸比色法【4】多糖被 濃硫酸水合時產生的高溫迅速水解生成單糖。該單糖在強酸 的條件下,與苯酚反應生橙色衍生物。此橙色衍生物在490nm 處有最大吸收峰,其吸光度與濃度成線形關系。從而確定本研 究的最大吸收峰為490nm。精密吸取對照品溶液0.1、0.2、 0.4,0.6、0.8、1.0mL。分別置10mL具塞試管中,分別加蒸餾 水至2.0mL,再各加苯酚試液1.0mL.搖勻,迅速滴加濃硫酸 5.0mL,搖勻后放置5min,置沸水浴中加熱15min,取出冷卻 至室溫;另取蒸餾水2mL。加苯酚和硫酸,同上操作為空白對 照。將上述溶液490nm處測定吸光度。 2.2地黃多糖降血糖作用的研究方法 2.2.1糖尿病動物模型建立(5-73:試驗動物普通飼喂一周。 試驗小鼠先禁食12h,正常飲水,基礎稱重。一次性腹腔注射 1%四氧嘧啶300mg?kg_‘,72h后,眼眶靜脈叢采血。測空腹 12h血糖,選擇血糖值大于15mmol?L-1的小鼠,確定為糖尿 病鼠。 2.2.2動物分組及處理:造模成功后,60只小鼠,隨機分為 模型組、阿卡波糖治療組(AR治療組)、地黃粗多糖治療組 (RGP治療組),每組小鼠20只;同時選擇20只正常小鼠設 為正常組。RGP治療組從造模成功第二天開始灌胃,劑量為 300mg?(kg?d)。AR治療組用20mg?(kg?d)阿卡波糖溶液灌 胃,正常組和模型組則每天灌胃同體積的生理鹽水,試驗中不 給與胰島素和任何降血糖的藥物。試驗周期為4周。 2.2.3指標檢測方法:①體重:試驗期間每隔州稱一次,每組 測定4周末的平均體重。②血糖(GLU)測定:造模成功后。于 灌胃各種受試物后4周末,每組小鼠眼眶靜脈叢取血。分離血 清。按試劑盒說明書,采用全自動生化分析儀測定。③TC、 TG、VLDL-C的測定采用全自動生化分析儀測定。 2.3統計學方法所有計量資料采用均數±標準差表示(x ±s),統計處理先用F檢驗。再行q檢驗。配對資料采用配對 t檢驗。數據分析采用SPSSl3.0統計分析軟件。P<0.05為 差異有統計學意義。 3結果 3.1地黃多糖的提取分離結果 3.1.1地黃多糖純度的光譜分析結果:光譜顯示地黃多糖具 有多糖特征性的紫外吸收圖譜。僅在200nm處有一銳細吸收 峰,大于250am無明顯的紫外吸收.是平坦的背景。結果表 明,提取純化的多糖中不含有核酸、蛋白質以及其他雜質成 分。 3.1.2工作曲線回歸方程的建立:經實驗表明:葡萄糖的濃 度x和吸光度Y之間的線形回歸方程為:Y=0.0056X+ 0.4361,相關系數R2=0.9995。得葡萄糖的標準曲線(見圖 1)。葡萄糖標準溶液以苯酚一硫酸法測定時的最大吸收波長 在490nm處,故選擇490nm作為地黃多糖的檢測波長。 圖1葡萄糖的標準曲線 3.1.3樣品含量的測定:取供試品溶液在490nm測定吸光 度,計算地黃粗多糖的提取率和總糖平均含量,地黃粗多糖的 提取率為45.5%.總糖平均含量為35.2%。 3.2地黃多糖對血糖和血脂的影響實驗結果 3.2.1地黃多糖xCd,鼠體重和血糖的影響:用藥4周末。與正 常組相比,模型組體重降低、血糖升高,相比較有顯著性差異 (P<o.05);AR治療組、RGP治療組與模型組相比.體重增加、 血糖降低,相比較有顯著性差異(P<0.05)。結果(見表1)。 表l地黃多糖對糖尿病小鼠體重和血糖的影響fx±s-n=20) 刪1麗叢‰麗—右產‰ 注:與正常組‘P<0.05;與模I宰|組比較’P<f.05 3.2.2地黃多糖對小鼠血清血脂水平的影響:模型組血清血 脂水平顯著高于正常組(P<0.05)。可見糖尿病能引起血脂 紊亂。治療后,AR治療組、RGP治療組與模型組比較。TG、 VLDL-C降低.相比較有顯著性差異(P<0.05);治療組與模 型組比較TC水平變化不大。差異無統計學意義(P>0.05)。 結果(見表2)。 4討論 4.1地黃多糖含量測定方法的建立多糖總糖含量測定是 多糖提取分離的基礎。一般依靠糖類物質的特征顏色反應進 行。就反應的化學過程而言。可以分為兩類:①以無機酸(硫 酸或鹽酸)使糖類脫水形成呋喃醛類衍生物,進一步與酚類或 含氮堿縮合生成有色物質;⑦以堿處理糖類,產生復雜的裂解 衍生物,與某些試劑相作用.呈現特殊顏色。目前常用的多糖 分析檢測方法有:苯酚,硫酸、葸酮一硫酸和3,5一二硝基水楊酸 (簡稱DNS)法【4J。本實驗選用苯酚.硫酸對地黃粗多糖總糖 含量進行測定。結果表明改進后的苯酚.硫酸顯色后在 ?31? 萬方數據 換頁 海峽藥學2010年第22卷第9期 490nm有最大吸收。本實驗中通過對苯酚一硫酸法的方法學 考察,表明其方法可靠簡便易行、快速靈敏、精密度高、顯色穩 衰2地黃多糖對小鼠血清血脂水平的影響I;±s.mmol?L~.n=20} 定、重復性好、準確度好。可以作為地黃多糖含量測定的有效 方法。 組別 TGVLDL.CTC 治療前治療后治療前 治療后治療前 治療后 注:與正常組‘P<O.05;與模型組比較。P<O.05 4.2地黃多糖的分離純化乙醇作為多糖常用的一種沉降 荊.其濃度與提取液的濃縮程度是影響沉降效果的關鍵因素。 醇析時乙醇濃度過低,溶液中的多糖不能完全沉淀出來,而乙 醇濃度過高會促使溶液中其他成分連同多糖一起析出,乙醇 濃度在75%~85%范圍內較好.未經濃縮的多糖提取液由于 多糖含量較低。加入沉降劑后多糖濃度進一步下降,不利于多 糖沉淀。本文采用75%酒精沉淀得到的地黃粗多糖,經光譜 分析地黃粗多糖的提取率高,其總糖平均含量亦較高。地黃 多糖在空氣中提取或干燥時顏色會加深,本研究中我們在地 黃多糖提取液除去色素的過程中用1%的活性炭。但在脫色 時活性炭使用量大。樣品損失較多,后改為H2()2脫色除去色 素效果較理想,因此在地黃多糖提取液脫色以H202為佳。 本實驗中,我們采用Sevage法脫除蛋白質的過程中,多糖損 失較大,這可能是由于地黃中的多糖主要以糖肽和糖蛋白的 形式存在。因此,應對地黃脫除蛋白的過程中為避免多糖的 損失而進一步研究。 4.3地黃多糖對糖尿病小鼠體重的影響本試驗小鼠腹腔 注射四氧嘧啶后,血糖升高到15.94mmol?L~,出現了糖尿 病“三多一少”典型癥狀,說明糖尿病模型復制成功。四氧嘧 啶是一種p細胞毒劑,可選擇地損傷小鼠的胰島B細胞。造成 胰島素分泌低下,從而導致血糖升高而引起試驗性糖尿病【8】。 四氧嘧啶能選擇性地破壞胰島B細胞致使胰島素分泌功能喪 失,造成內分泌功能紊亂。使糖、脂肪、蛋白質等代謝失調.而 代謝失調又進一步引起負氮平衡,使機體消瘦而體重下降【9】。 本試驗結果表明,地黃多糖治療組小鼠在治療后體重顯著上 升,與模型組小鼠體重相比顯著升高(P<0.05).可見地黃多 糖能緩解糖尿病所致的體重降低。 4.4地黃多糖對糖尿病小鼠血糖及血脂的影響四氧嘧啶 誘導的糖尿病小鼠模型,在出現高糖血癥的同時,會并發高脂 血癥,其中甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇明顯升高,血脂的 改變可能是高血糖并發的脂代謝紊亂所致,以高甘油三酯和 高低密度脂蛋白膽固醇為特征的脂代謝紊亂是糖尿病腎病的 重要高危因素“oj。糖代謝和脂代謝之間有著密切聯系,高糖 ?32? 血癥為原發性改變,高脂血癥為繼發性改變,因此糾正糖脂代 謝紊亂是治療糖尿病及其并發癥的重要手段(1l】。本試驗研 究結果表明,地黃多糖能顯著降低糖尿病小鼠的血糖值,至療 程結束后,血糖值逐漸降低接近正常,同時甘油三酷和低密度 脂蛋白膽固醇明顯降低。表明地黃多糖能夠降低糖尿病小鼠 血糖水平,調節血脂紊亂,具有一定的調節糖脂代謝作用。其 作用機理可能是:地黃多糖對糖尿病小鼠胰島8細胞有一定 的修復作用【12】,使胰島素分泌增多從而改善糖代謝和脂代 謝。 參考文獻 【1]劉福君,趙修南.聶偉.等.地黃低聚糖增強小鼠免疫功能的作用 【J].中國藥理學學報。1998,14(1):90.94. 【2】中華醫學會心血管病學分會.全國冠心病與糖尿病關系研討會紀 要[J].中華心血管病.2004,32(2):183.184. 【3]陳力真,馮杏婉.周金黃,等.地黃多糖b的免疫抑瘤作用及其機 理【J).中國藥理學與毒理學雜志。1993。7(2):153.156. C4)邊寶林,王宏潔.倪慕云.地黃及其炮制品中幾種主要糖的含量測 定(J】.中國中藥雜志。1992.20(8):469.471. (5]張汝學.顧國民.張永祥.等.地黃低聚糖對實驗性糖尿病與高血 糖代謝大鼠糖代謝的調節作用【J】.中藥藥理與臨床.1996。(1): 14一17. [6】苗明三.實驗動物和動物實驗技術[M).北京:中國中醫藥出版 社,1997:240.241. 【7】中國人民共和國衛生部藥政局.中藥新藥研究指南(藥學,藥效 學,毒理學)[MJ.北京:人民衛生出版社,1994:84.55. C8)方厚華,仇志華.糖尿病動物模型的研究進展【J】.實驗動物科學 與管理,2001,18(2):39—42. 【9】楊明華。柴可夫.楊蘇蓓.四氧嘧啶致糖尿病大鼠模型血糖穩定性 考察(J】.中國比較醫學雜志.2006,8(16):482.484. ClO】陳漢桂,郭厚基.荔枝核提取液對糖尿病小鼠模型血塘、血脂等 相關指標的干預效應【J】.中國臨床康復,2006,10(7):79.81. Cn】王庭樣.王庭欣,何云.海帶多糖對糖尿病大鼠血糖的影響(J】. 中華臨床衛生。2003,2(1):lO.12. C12]劉福君.程軍平。茹祥斌.等.地黃多糖對小鼠造血功能的影響 U).中國病理學與毒理學雜志,1994,8(2):118.120. 萬方數據 換頁

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