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    FISH檢測子宮頸脫落細胞hTERC基因的表達及意義
    關鍵字:基因,表達,意義,細胞,檢測,子宮,IJ,KL,GH,EF, 發布時間:2011-08-21

    第30卷第4期 2010年8月 贛南醫學院學報 JOURNALOFGANNANMEDICALUNIVERSITY %Z.30^幻.4 4UG.2010 FISH檢測子宮頸脫落細胞hTERC基因的表達及 jk’、,。 思X 盧義生’,冼麗英1,侯智勇1,劉 軍1,陳國明1,韓淑珍2,趙繼紅1,羅淑貞1,陳建華1 (1.東莞市人民醫院;2.東莞市厚街醫院,廣東東莞523000) 摘要:目的:探討人類3號染色體端粒酶(hTERC)基因在宮頸上皮內瘤變(CIN)患者的表達及臨床意義。方 法:收集2008年1月至2008年lo月東莞地區100例宮頸脫落細胞標本,其中CIN患者63例、宮頸鱗癌(SCC)患 者7例、正常細胞學或炎癥婦女30例,用熒光原位雜交(FISH)方法檢測宮頸脫落細胞hTERC基因。結果:在 CINI、CINⅡ/Ⅲ和SCC患者宮頸脫落細胞中hTERC基因的表達率分別是15.15%、89.67%和100%。GINI、 CINⅡ/Ⅲ和SCC組與正常組比較,hTERC基因陽性率差異有顯著統計學意義(P<O.001),其中,CINI與GINII/ Ⅲ比較,CINⅡ/Ⅲ與SCC比較差異有統計學意義(P<0.05)。隨著病變程度增加,hTERC基因表達率增加。 hTERC基因檢測CINⅡ/III的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為86.67%、92.06%、83.87%和 93.53%。CIN和SCC組病例與正常或炎癥組比較,hTERC基因擴增比例增加,可觀察到明確的超二倍體現象。 hTERC基因的表達水平與宮頸病變的程度關系密切。結論:hTERC基因在CIN和SCC中表達異常,隨著病變程 度增加其陽性率增加,可作為宮頸病變惡性進展的監測標志。 關鍵詞:熒光原位雜交;端粒;染色體末端轉移酶;宮頸上皮內瘤變 中圖分類號:R446.1l+3文獻標志碼:A文章編號:100l一5779(20lo)04—0533—04 Expressionofthehumantelomerasegeneinexfoliativecytesofcervix LUYi?sheng,XIANLi?ying,HOUZhi?yong。etal (DongguanPeople§Hospital,Dongguan Guangdong523018) Abstract:Objective:Toevaluatetheffigniflcanceofexpressingthehumantelomerusegene(hTERC)intheexfoliative eytesofcervixbydual—colorinterphusefluorescenceinsituhybridization(FISH).Methods:Thefluorescencesignalin thecellsWeredetectedbyusinginterphaseFISH.Wecoleeted100specimensinDongguangfromJanuary,toOctoberof 2008anddetectedtheexpressionofhTERCgeneincellsfrom63cervicalintraepthelialneoplasia(CIN),7squamouse/lr- cinomasofthecervix(SSC)and30nomalcervix orchroniceervicitis.Results:PositiveexpressionratesofthehTEHC geneinCINI、CINII/llIandSSCwere15.15%,89.67%and100%.Comparedwithcontrolcervix orclLromceonvici. tis,hTERCgenepositiveexpressioninCINandSSCweredifferentsignificantly(P<0.001).Therewas asigniflcandy differencebetweenCINIandCINI/m(P<0.05),alsobetweenCINI/ⅢandSSC。Theexpressionrateofthe hTERCgenewasincreasedwiththeseverityofthedisease.Thesensitivity、specificity、positivepredictedvalueandnega— tirepredictedvalueofhTERCgenewhichdetectedinC1NII/Ⅲwere86.67%、92.06%、83.87%and93.53%reapee- tively.Comparingwiththecontrolgroup,the rateofhTERCgeneamplificationwasincreasedinCINandSSC.Weob— selweclhyperdiploidcellinCINandSSC.Conclusion:TheincreaseofhTERCgeneexpressionintheSCCandGINsug- geststhathTERCgene眈rves as ascreeningtestmarkerforhelpingtodeterminetheprogressivepotentialofindividualle? sions. . Keywords:fluorescentinsituhybridization;telomerase;cervicalintraepithelialneoplasia 宮頸癌是女性最常見的第二位惡性腫瘤,早期 診斷和治療能改善患者預后。大部分低度宮頸上皮 內瘤變(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)能自 然消退,僅少部分CINlI/Ⅲ發展到宮頸澎,而目前 宮頸癌篩查主要通過宮頸脫落細胞學檢查及FIPV 檢測,兩者均有一定局限性。因此,有必要尋找新的 ?基金項目:衛生部科研基金課題(編號:WKJ2007—3—001) .—~533?-—— 萬方數據 換頁 贛南醫學院學報2010年 指標來協助診斷官頸癌前病變,以提高篩查的準確 性和可預測性,以早期發現CIN向浸潤性宮頸癌的 發展。人端粒酶RNA(hTERC)是人端粒酶組分之 一,有研究證實,端粒酶激活是HPV整合入宮頸細 胞后,上皮內瘤變(CIN)向宮頸癌轉化的關鍵步 驟…。本研究通過熒光原位雜交(fluorescenceinsi. tuhybridization,FISH)法檢測官頸脫落細胞學涂片 中hTERC基因,探討hTERC基因在CIN和宮頸鱗 癌(squamouscarcinomasofthecervix,SCC)的表達 及其臨床意義。 1資料和方法 1.1資料來源收集2008年1月至2008年10月 東莞地區100例患者的官頸脫落細胞標本。患者年 齡20一65歲,平均(36.5土10.4)歲,均為已婚或有 性生活婦女。依據CIN處理指南,對異常細胞學進 行高危HPV—DNA檢測和陰道鏡檢查,并經陰道鏡 取活檢,常規送病理檢查。 1.2涂片判斷標準和分組根據TBS(thebethesda systerm)2001年陰道/宮頸細胞學診斷系統進行細 胞學診斷。按細胞學分組分為正常或炎癥細胞涂片 組、ASCUS組、LsIL組和HSIL組。所有FISH檢測 用涂片,經10%抽樣,并由本科細胞學醫師診斷,和 其細胞學涂片結果對照,符合率為100%。依據組 織學的病理結果分為正常或炎癥組、CINI組、CIN Ⅱ/Ⅲ組和鱗狀細胞癌(SCC)組。 1.3細胞標本采集 用薄層液基細胞學宮頸刷插 人宮頸口,在宮頸外口鱗柱狀上皮交界處,以宮頸外 口為中心,均勻旋轉3—5周,取出宮頸刷。 1.4制作方法用TCT低滲制片,將TCT保存液 瓶中剩余的液體(>5mL),I500r/min離心5rain, 加膠原酶B,37℃水浴20rain,再離心,加5mL去 離子水37%水浴20~40rain,生理鹽水液漂洗沉 渣,重復2次;加2-5mL37%KCI低滲液重新吹打 懸浮細胞,置37℃水浴箱中孵育20min,離心、加入 5mL固定液(甲醇:冰乙酸3:1)固定10rain。離 心后棄上清,將細胞滴于玻片制片。 1.5FISH法hTERC基因檢測 (1)探針:hTERC 探針由北京金菩嘉醫療科技公司提供,為hTERC/ CSP3DNA探針,hTERC基因位于3q26.3,此區域包 含人類端粒酶基因的RNA組分,模板由11個核苷 酸組成,序列57一CUAAC—CCUAAC一3hTERCDNA 探針雜交到3號染色體長臂26.3,熒光信號為紅色 (四甲基羅丹明),CSP3DNA雜交到3號染色體著 .-——534...。 絲粒(3plI.1一q11.1),熒光信號為綠色(細胞綠), CSP3作為對照探針,hTERC作為檢測探針;(2)涂 片預處理:涂片置于2XSSC(pH7.0)5rain×2, 0.1moVLHCI1—2rain。0.01mol/LHCL和胃蛋白 酶混合液2min,室溫下l×PBS洗脫3次,70%、 85%和100%乙醇梯度脫水固定,自然干燥;(3) FISH操作步驟:避光環境中,玻片和探針混合液 (7“L雜交緩沖液、l斗L去離子水和2弘L探針),在 70%甲酰胺+2×SSC變性液中,(73±1)℃變性 5rain,用一20℃預冷的70%、85%和100%乙醇梯 度脫水3rain,玻片自然干燥,置人45—50℃烤片機 預熱后與探針雜交,10肛L探針混合液滴于雜交區 域,加蓋蓋玻片,封片,42%保溫箱過夜雜交。次日 玻片洗脫:移去蓋玻片,46℃下玻片置于50%甲酰 胺+2 xSSC混合溶液,10rain×3,再置于2×SSC 溶液10rain,最后于2×SSC+0.1%NP40混合溶液 中5min。玻片干燥后加16trLDAPI復染液,放于 暗盒復染45~60rain。 1.6FISH信號的判斷 (1)用OLYMPUSB×51 熒光顯微鏡在DAPL/FIFC/TexasRed三色濾光鏡激 發下觀察間期細胞熒光雜交信號,用VideoTest公司 提供的FISH分析軟件分析圖像,評估整個涂片的 CSP3和hTERC基因雙色探針雜交情況。(2)判斷 標準:選取20例正常宮頸細胞涂片,每例切片至少 分析100個檢測細胞,統計正常宮頸細胞涂片上皮 細胞中出現綠:紅<2:2的百分比,超過平均百分 值+3個標準差則可診斷為hTERC基因有擴增。 統計各組宮頸病例中各種異常信號細胞的百分率。 按觀察到的信號數記錄為CSP3信號數:hTERC信 號數,二倍體記錄為2:2,hTERC異常信號的各種 類型記錄為2:3,2:4,3:3,4:4及其他等。 1.7統計學處理用SPSS13.0軟件進行統計學 分析,比較各級病變hTERC的表達,采用x2檢驗, 檢驗標準d=0.05。 2結果 2.1正常宮頸細胞hTERC基因雜交信號分布情況 以20例正常富頸病例作為正常對照并確立閾值, 每例樣本計數100個,hTERC基因雜交信號(n)分 布情況如下:列入計數的2000個細胞中,以綠:紅 熒光信號為2:2為主(90.55%),部分患者出現2 :3(6.9%)。2:4(0.7%),3:3(O.9%)。4:4 (0.25%)及其他(o.7%)類型信號。按照上述雜交 信號的結果判定方法:以正常宮頸脫落上皮中 萬方數據 換頁 4期 盧義生,等FISH檢測子宮頸脫落細胞hTERC基因的表達及意義 hTERC基因雜交信號為標準確定,11≥3的細胞百分 值Mean=1.75SD:I.49mean4-3SD=lI.67,多體 型(n≥3)百分比上限為11.67,大于此上限者可認 為hTERC基因有擴增。 2.2CIN患者宮頸脫落細胞hTERC基因的表達 可用于分析結果的宮頸細胞學涂片共100例,其中, 正常或炎癥組涂片30例,異常細胞學涂片70例,后 者包括ASCUS41例,LSIL36例,HSIL21例。細胞 學與組織學的情況,見表I。100例涂片組織學分組 hTERC基因表達見表2。正常或炎癥組hTERC基 因陽性率為O%(0/30例),CINI、CINII/llI、SCC 組與正常組比較,hTERC基因陽性率有顯著差異(P <0.001)。其中CINI與CINⅡ/Ⅲ,CINII/Ⅲ與 SCC差異有顯著統計學意義(P<0.01),隨組織學 病變程度增加,hTERC基因陽性率增加。 表l組織學各組的細胞學情況n(%) 表2組織學各組hTERC基因表達情況 紐別 正常或炎癥 CINI CINII/nl SCC n 辟j性 300 335 3026 77 % 0 15.15 86.67 100 細胞學各組ASCUS、LSIL與HSIL組和正常組比 較,hTERC基因陽性率差異有顯著統計學意義(P< 0.001),隨細胞學病變程度增加,hTERC基因陽性 率增加,其中ASCUS與HSIL組比較,有顯著統計學 意義(P<0.05),LSIL和HSIL組比較,有顯著統計 學意義(P<0.05),見表3。 表3細胞學各組hTERC基因的表達 n 陽性 2 0 41 9 36 10 2l19 % O 22.O 27.78 90.48 2.3hTERC基因預測CINⅡ/Ⅲ的每吏感度和特異度 hTERC檢測CINn/IlI敏感度、特異度、陽性預測 值和陰性預測值分別是86.67%、92.06%、83.87% 和93.53%。 2.4hTERC基因擴增類型CIN和SCC組病例與 正常組比較,hTERC基因異常擴增增加。正常組的 宮頸細胞中,3號染色體hTERC基因多表達為兩個 雜交信號,而CIN和SCC組常可觀察到明確的超二 倍體現象,擴增類型多為(CSP3:hTERC)2:3,、2 :4、3:3、4:4等類型,見圖l、圖2。分布情況 見表4。 表4組織學各組hTERC基因擴增類型 3討論 3.1端粒酶與hTERC的結構和生物學特性人類 染色體端粒酶是由RNA和蛋白質組成的依賴RNA 的DNA聚合酶,能以自身攜帶的RNA為模板,以3’ 端粒為引物來合成端粒DNA,其功能是維持真核細 胞染色體末端端粒的長度,具有保護染色體末端波 降解以及和其他染色體連接的作用。端粒酶由人端 粒RNA亞單位(humantelomeraseRNA component, hTERC)、人端粒酶逆轉錄酶的蛋白亞單位(human telomerasereversetranscriptase,hTERT)和相關蛋白 l(TEPl)3個部分組成。其中hTERC為端粒酶的 主體結構,同時具有逆轉錄合成人端粒TTAGGG重 復序列的功能[2】,hTERT常常只在增殖的細胞中表 達。正常體細胞的端粒是隨著有絲分裂次數的增加 而逐漸縮短,當端粒縮短到一定程度時,細胞停止分 裂,進入衰老期,當端粒酶活化時,端粒不再繼續縮 短而保持平衡狀態,使細胞無限制分裂繁殖。因此, 端粒酶的活化是細胞永生化或惡性化的重要事件。 3.2hTERC基因異常與宮頸病變的相關性在對 宮頸病變的研究中,宮頸細胞由CIN向宮頸癌轉變 的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂的擴增,其中, 所涉及最重要的基因可能是人染色體端粒酶基因。 Heselmeyer—Haddad等…采用FISH三色探針檢測宮 頸涂片hTERC基因,發現LSIL中hTERC基因陽性 率占7.14%,HSIL占76%,四倍體細胞數和laTERC .—一535,.一 一癥~炎 ~或坶 塑脯刪吼吼 萬方數據 換頁 贛南醫學院學報2010年 基因擴增隨細胞學病變的嚴重程度增加,認為檢測 hTERC可作為預測高度病變(HSIL)的指標,隨訪這 些病例l一3年后,hTERC擴增病例中,CINI/Ⅱ進 展到CINⅢ者多于陰性病例,表明特異的基因組改 變是CIN發展到浸潤癌所必需的Hj。2003年Ker. stin等H1采用FISH技術檢測宮頸涂片中的 3q26hTERC基因,發現四體型細胞數和hTERC基囚 隨細胞學病變的嚴重程度而增加。2008年Nancy 等¨’通過FISH分析了66例不同級別的宮頸液基 制片后發現,hTERC基因的表達在HSIL/SCC組與 正常/ASCUS組問差異有統計學意義,HSIIMSCC組 基因擴增的百分率明顯高于正常/ASCUS組。我們 對100例患者進行分析發現,33例CINI中hTERC 基因擴增陽性率為15.15%,30例CINⅡ/11為 86.67%,7例SCC為100%,隨著病變升級,hTREC 基囚擴增比例增加。Olaharski【61用雙色熒光原位雜 交法研究ASCUS、LsIL和HSIL患者的宮頸涂片,顯 示3號染色體四倍體和非整倍體發生頻率增加,且 隨病變進展,非整倍體發生頻率增加明顯,出現三倍 體的特殊類型。在本研究中,隨著病變升級,hTREC 基因異常擴增增加,也可觀察到明確的超二倍體現 象,同時發現,與正常宮頸相比,CIN中出現了四體 型與多體型,并隨著病變進展,異倍體比例增加。由 此可見,宮頸癌和CIN常見染色體增加、缺失等非 整倍體染色體不穩定現象,hTERC基因異常的染色 體不穩定性與宮頸癌的發生關系密切,3q染色體不 穩定可能是宮頸癌前病變發展到宮頸癌的因素之 ’。一O 3.3在宮頸細胞涂片中,檢測hTERC基因的意義 目前宮頸癌的早期篩查主要依靠液基細胞學檢查 結果,細胞學檢查是一種形態學檢查,受取材、制片 質量和判讀者主觀因素影響較大。液基細胞學檢查 提示ASCUS、LSIL較多,這些病例經陰道鏡檢查可 能未發現異常,但在隨訪的過程中病情進展迅速,甚 至很快發展成浸潤性癌,這可能與病變位于子宮頸 管有關,而陰道鏡不能發現14%的子宮頸管內病變 及25%~30%的微小浸潤癌。而hTERC基因在宮 頸病變的早期表達,成為宮頸病變早期診斷的新靶 點,其含量隨病變的發展而進行性發展,hTERC基 因檢測對于子宮頸癌前病變的早期診斷和篩查具有 重要的臨床價值。FISH方法操作相對簡單,穩定性 較好,不需要細胞培養,可在早期發現少量病變細胞 遺傳學異常。用FISH方法,在常規收集的宮頸細 .--——536-—-—— 胞中檢測hTERC基因的擴增和染色體3著絲粒,使 染色體的非整倍體客觀上可見,成為可用的檢測方 法。HeselmeyerHaddad等p1報道FISH方法hTERC 基因檢測預測CINI/Ⅱ進展到CINm的敏感性是 100%,特異性是70%,表明檢測hTERC基因可作為 預測CINlI/III發展到宮頸癌的指標,可以早期發現 癌前病變發展到官頸癌的危險幾率,為宮頸癌提供 了一種有用的生物遺傳學監測指標。本研究 hTERC基因診斷CINII/Ⅲ的特異度和陰性預測值 較高,具有一定的臨床應用價值。 綜上所述,采用FISH方法檢測端粒酶hTERC 基因的表達,可以早期發現發生癌變的趨勢,可作為 預測宮頸病變發展到宮頸癌的生物遺傳學監測指 標,并有望成為宮頸癌早期篩查方法,其在腫瘤的研 究及臨床方面具有廣闊的應用前景。 (本文圖片見封二) 參考文獻: [1]Hoselmeyer-HaddadK,JanzV,CastlePE,eta1.Detection ofgenomicamplificationofthehumantelomerasegene (TERC)incytologicspecimensas agenetictestforthe diagnosisofcervicaldysplasia[J].AmJofPmhd,2003。 163:1406—1416. [2]FengJ,FunkwD,WangSS,cta1.theRNAcomponentof telomerasc[J].Science,1995,269(7):1236—1241. [3]tteselmeyer-HaddadK,ScmmerfeldK,WhiteNM,eta1. Genomicamplificationofthehumantelomerasegene (TERC)inpapsmea昭predictsthedevelopmentofcer- dealcaner[J].AmJPathol,2005,166:1229—1238. [4]KerstinHH,ViktorJ,PhilipE,eta1.Detectionofgenomie amplificationofthehumantelomerasegene(hTERC)in eytdorespecimensas agenetictestforthediagnosisof cervicaldysplasia[J].AmericanJournalofPathology。 2003,163:1406—1416. [5]NancyP,CarawayAK,MarilynD,eta1.Gainofthe3q26 regionincervicovaginalliquid—basedpappreparationsis associatedwithsquamotmintraepitheliallesionsandsqua- mollscellcarcinoma[J].GynecologicOnedogy,2008, t10:37-42. [6]OlaharskilAJ。SoteloR,Soloma—L岫aG,eta1.Tetraploidy andchromosomalinstabilityareearlyeventsduringcervi? calcarcinogenesis[J].Carcinogenesis,2006,27:337— 343. (收稿日期:2010—06一02) 萬方數據 換頁

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